2-wöchiger Laborkurs

Ich hatte keine Ahnung, wie viel Arbeit es macht, einen praktischen Laborkurs zu organisieren. Hätte ich das gewusst, hätte Pirjo  es viel schwerer gehabt, mich davon zu überzeugen, diesen Kurs für das DPBM-Graduiertenkolleg  zu veranstalten. Kari  hatte mich gewarnt… Der dazugehörige Vorlesungskurs hatte von September bis November stattgefunden. Der Praktikumskurs war mit 16 freien Plätzen ausgeschrieben worden, doch das war völlig unrealistisch, da wir auf meine 23,7 Quadratmeter Laborfläche beschränkt waren. Es gibt zwar Lehrlaborräume, aber ohne die Ausrüstung und die gesamte sonstige Infrastruktur, die für ein solches Vorhaben erforderlich ist. Acht Personen hatten sich für den Praktikumskurs angemeldet, und – glücklicherweise – sprang die Hälfte davon in letzter Minute ab, da sie sich der hohen Arbeitsbelastung, die der Kurs erforderte, nicht in ausreichendem Maße widmen konnten. So blieben schließlich vier Studierende und drei Projekte übrig. Mit mehr hätten wir es auf keinen Fall geschafft. Die Idee war, jedem Teilnehmer die Möglichkeit zu bieten, sein eigenes Projekt zur DNA-Klonierung und Proteinexpression zu realisieren – etwas, das für sein eigenes Promotionsstudium relevant wäre. Zu diesem Zweck hatte ich einen Monat im Voraus Besprechungen mit den drei Gruppen, um die Klonierung zu planen und die notwendigen Materialien zu bestellen. Wir arbeiteten parallel an den folgenden drei Projekten:

1. Expression von MSP1 in CHO-Zellen (sowohl transient als auch stabil)
2. Expression von humanem AR in 293T-Zellen (transient)
3. Herstellung eines Plasmids, das durch ein Restriktionsenzym in eine DNA-Leiter mit perfekt gleichmäßigen Abständen gespalten werden kann

Als ich mit meiner Einkaufsliste zum City Lab ging, gab es bei Thermo Fisher  eine Verkaufsaktion (-33 % auf alle Enzyme). Ich gab die Bestellung bei Fisher Scientific auf und teilte dem Vertriebsmitarbeiter ausdrücklich mit, dass ich die Produkte eine Woche vor Kursbeginn benötigen würde; der Vertriebsmitarbeiter bestätigte, dass es absolut kein Problem sei, alle Artikel rechtzeitig zu liefern. Tatsächlich wurde die Lieferung jedoch in zwei Teile aufgeteilt: die reduzierten Artikel und die nicht reduzierten Artikel. Zwar hatte ich beide Teile bestellt, doch aufgrund eines Fehlers seitens Thermo Fisher gelangten nur die rabattierten Artikel in das interne Bestellsystem von Thermo Fisher. Als die Lieferung eintraf, wurden alle Artikel in den Gefrierschrank bzw. Kühlschrank geräumt, aber niemand dachte daran, zu überprüfen, ob auch wirklich alle Artikel geliefert worden waren. Als ich am Wochenende vor dem Kurs nachschaute, ob alles angekommen war, was wir bestellt hatten, stellte ich fest, dass Material fehlte… Und ich rannte herum, um sicherzustellen, dass wir das gesamte Material, das noch nicht angekommen war, ausleihen konnten. Thermo Fisher brauchte bis zum 10. Dezember, um alle Artikel zu liefern. Bis dahin hatten wir das meiste von dem, was wir geplant hatten, bereits erledigt.

Ein weiterer Wermutstropfen war, dass Dharmacon/GE Healthcare  nicht in der Lage war, die cDNA des menschlichen Androgenrezeptors ( BC132975  , Klon-ID: 40146997) aus der Mammalian Gene Collection  zu liefern. GE Healthcare gibt auf seiner Website an: „Lieferung nach Nordamerika innerhalb von 2 Tagen (außerhalb Nordamerikas eine Woche länger)“. Doch selbst nachdem doppelt so viel Zeit vergangen war, war die Lieferung noch nicht eingetroffen, und wenige Tage vor Kursbeginn versuchte ich verzweifelt, ein Ersatzprojekt auf die Beine zu stellen. Es gelang mir, eine cDNA des Ratten-Androgenrezeptors von Päivi Pihlajamaa zu erhalten, und am letzten Freitag vor Kursbeginn sequenzierte Tapio noch die Konstrukt-Übergänge. Das Konstrukt schien klonierbar zu sein; ich führte über das Wochenende eine DNA-Aufbereitung durch und überarbeitete den Klonierungsplan. GE Healthcare entschuldigte sich vielmals für die nicht erfolgte Lieferung und versprach, den menschlichen Androgenrezeptor kostenlos zu liefern (was bis heute jedoch noch nicht geschehen ist)…

Der Kursplan war sehr eng und ließ keinerlei Fehler zu. Mehrmals dachte ich, dass ein Projekt vorzeitig enden würde. Ich finde es immer noch bemerkenswert, dass die Projekte 1 und 2 bis zum Schluss wie geplant funktionierten. Die größte Zitterpartie gab es bereits in Klonierungsschritt 1 von Projekt 1: Die Klonierung war nicht richtungsabhängig, und wir wählten viele Klone aus, um sicherzugehen, eine gute Ausrichtung zu finden. 9 Klone wiesen ein Insert auf, 8 in falscher Ausrichtung und einer (Klon 4) in der richtigen Ausrichtung. Im selben Klonierungsschritt fügten wir eine Chloramphenicol-Resistenz ein, doch die Studierenden plattierten fröhlich auf Ampicillin-Platten, obwohl sie das Hintergrundrauschen durch die Verwendung von Ampicillin/Chloramphenicol-Platten auf null hätten reduzieren können. Von den 40 Kolonien, die sie für die Minipreps auswählen mussten, wuchsen nur etwa 10, als wir beide Antibiotika für die Kultur verwendeten. Die Transfektion und der Nachweis verliefen reibungslos und ohne Probleme.

Für die abschließende Bildgebung verwendeten wir Licor’s Odyssey Fc  , das unser Forschungsprogramm einige Wochen zuvor angeschafft hatte, und ich war überrascht von seiner hohen Empfindlichkeit (ich nahm die ECL-Membran und belichtete sie mit Röntgenfilm, um ein Gefühl dafür zu bekommen, wie sie im Vergleich abschneiden). Wir hatten keine andere Wahl, als Projekt 3 nach den ersten beiden Klonierungsschritten (von insgesamt 3) abzubrechen. Als wir die Sequenzen des Konstrukts pOTB7-BglI2x-Insert überprüften, fanden wir eine Mutation in einer der BglI-Überlappungsstellen (diese Mutation beeinträchtigt zwar nicht die Spaltung, wirkt sich jedoch auf die Kompatibilität bei der Ligation aus). Wir sequenzierten zwei weitere Konstrukte, doch alle wiesen dieselbe Mutation auf, und wir stellten fest, dass bereits das Ausgangskonstrukt (pOTB7-PC5) diese Mutation enthielt. Da wir im letzten Klonierungsschritt auf den spezifischen Überhang angewiesen sind, der durch diese BglI-Stelle erzeugt wird, konnten wir nicht fortfahren, ohne diese Mutation zu beheben. Wir haben die Oligonukleotide für die Mutagenese sofort bestellt, doch für diesen Kurs war das Projekt damit beendet. Da Girma weiterhin daran interessiert ist, dieses Projekt abzuschließen, werden wir das Problem beheben und den fehlenden letzten Klonierungsschritt durchführen. Es wäre schön, einen eigenen DNA-Marker mit gleichmäßigen Abständen zu haben, der durch Restriktionsverdau eines DNA-Konstrukts hergestellt wird. Das hat vor 25 Jahren jeder verwendet: Lambda-HindIII oder etwas Ähnliches. Nur waren die Abstände zwischen den Fragmenten nie wirklich gut. In unserer Version der DNA-Leiter mit gleichmäßigen Abständen können wir ein HindIII/SpeI-Fragment in unseren Basisvektor (pOTB7-BglI2x) klonieren und in einem zweiten Verkettungs-Ligationsschritt bestimmt die Länge des HindIII/SpeI-Fragments den Größenabstand der resultierenden Leiter. In diesem Kurs haben wir ein 350-bp-Fragment verwendet, was uns eine DNA-Leiter wie diese ergeben hätte: 350, 700, 1050, 1400, 1750, 2100 usw.). Sobald wir dieses Konstrukt fertiggestellt haben, erhalten alle Studierenden das Plasmid und eine Aliquote der fertigen Leiter als Andenken. Da die Kosten für die Herstellung dieser Leiter etwa 40-mal geringer sind als der Kauf einer handelsüblichen DNA-Leiter, könnten wir sogar damit beginnen, sie kostenlos zu verschenken.

Manche Dinge bei der Vorbereitung dieses Kurses hätten einfacher sein können: Erst am letzten Kurstag erhielt ich von Gretchen Repasky den „DPBM-Leitfaden für Kursorganisatoren“. Warum habe ich nie erfahren, dass so etwas überhaupt existiert????? Johanna Timmerbacka, die ehemalige Koordinatorin der Graduiertenschule, muss sich wohl dasselbe gefragt haben: Ich habe ihr per E-Mail all die Fragen gestellt, die dieser Leitfaden beantwortet… Im Anhang zu diesem Bericht finden sich die Klonierungspläne und der Zeitplan für den Kurs. Die Sammlung der Protokolle und eine kurze Beschreibung der Ergebnisse werden so bald wie möglich nach dem Kurs hinzugefügt. Außerdem gibt es zwei Literaturhinweise (einen vom US-Patentamt  und einen aus dem Journal of Nucleic Acids  zu zwei alternativen Methoden zur Herstellung von DNA-Leitern. Fazit: Nächstes Jahr werden wir keine praktischen Übungen durchführen. Wir werden vor Computerbildschirmen sitzen. Vielleicht. Vorausgesetzt, wir finden im Biomedicum einen Unterrichtsraum mit einem Beamer, dessen Auflösung höher ist als 1024x768.