Leistung der HiLoad 26/60 Superdex PG-Gelfiltrationschromatographie-Säule

Die von uns am häufigsten verwendete Technik zur Proteinreinigung ist die Gelfiltration (auch als Größenausschlusschromatographie bezeichnet). Bei der Gelfiltration werden Proteine nach ihrer Größe getrennt (genauer gesagt nach ihrem „Stokes-Radius“, der weitgehend von ihrer Größe und Form bestimmt wird). Für die Gelfiltration großer Proteinmengen haben wir vor etwa 9 Jahren die HiLoad 26/60 Superdex 200 Prep Grade  von GE Healthcare erworben (das Modell 26/60 wurde inzwischen durch das HiLoad 26/600 ersetzt, beide sind jedoch nahezu identisch). Mit dieser Säule lassen sich zwei Proteine, deren Größenunterschied 100 % beträgt, sehr sauber trennen. Daher eignet sie sich zur Trennung von monomeren und dimeren Formen desselben Proteins. Das „Verfallsdatum“ der Säule war März 2012. Nach unserer Erfahrung kann eine solche Säule bei sachgemäßer Handhabung problemlos eine Lebensdauer von 10 bis 15 Jahren erreichen (wir verwenden sie nicht sehr oft, lagern sie in 20 %igem Ethanol und bewahren sie bei +4 °C auf, wenn wir sie über längere Zeit nicht benötigen).

Trotz ihrer hervorragenden Leistung und ohne ersichtlichen Grund kam es Ende letzten Jahres zu einer drastischen Verringerung der Trennleistung, verbunden mit einer erheblichen Überlappung des dimeren und monomeren Peaks unseres PET-Proteins VEGF-C. Wir testeten die Säule mit dem Standard-Leistungstest für Gelfiltrationssäulen  (0,5 ml 2-prozentige Aceton-Probe) und stellten fest, dass von den theoretischen Platten pro Meter (TP/m) dieser Säule nur noch etwa 1.400 übrig waren (GE verspricht >13.000 für die neue Säule). Um die Ursache des Problems zu ermitteln, injizierten wir eine 20-prozentige Bromphenolblau-Lösung in 20-prozentigem Ethanol und konnten beobachten, dass das Problem am oberen Ende der Säule auftrat, wo die Probe in das Gelbett eintrat (siehe Abbildung oben).Der Kunststoffkolben (siehe Abbildung links) ist an seiner Unterseite mit einem Ring aus einem feinmaschigen Kunststoffnetz abgedeckt, und an der Verbindungsstelle zwischen diesem Netz und dem Kolben trat die Probe unregelmäßig aus, was zu einem starken Tailing (und damit zu breiten, asymmetrischen Peaks) führte. Wir tauschten den Netzring gegen ein Ersatzteil aus, doch die Situation verbesserte sich überhaupt nicht; es kam weiterhin zu massiven Leckagen. Ich vermutete, dass das Ersatzteil nicht mehr einwandfrei war, da es zusammen mit der Säule geliefert worden war und im Laufe der Zeit gealtert war, wodurch es seinen Weichmacher verloren hatte. Es war sehr steif und unnachgiebig, und schon beim Aufschieben auf den Kolben hatte ich den Verdacht, dass es nicht gut genug abdichten würde. Während wir auf eine neue Packung mit neuen Netzringen warteten, versuchten wir, unsere eigene Dichtung aus Parafilm zu schneiden. Dadurch verbesserte sich der TP/m-Wert zwar von 1400 auf 2800, doch wir konnten immer noch erhebliche Leckagen beobachten. Als wir schließlich sowohl den Kolben als auch den Netzring gegen neue Ersatzteile austauschten, maßen wir etwa 17000 TP/m. Der Peak wurde wieder symmetrisch und schmal, was bereits mit bloßem Auge zu erkennen war (Bild rechts). Wir waren jedoch überrascht, dass die Leckage zwischen dem Kolben weiterhin auftrat (siehe unten), wenn auch in viel geringerem Ausmaß und gleichmäßiger. Ich frage mich, ob diese „Grund“-Leckage auch bei völlig neuen Säulen auftritt.

Ich weiß es nicht, da wir unsere Säule im Neuzustand nicht mit einer farbigen Lösung getestet haben. Wir haben lediglich den Aceton-Test und einen Funktionstest mit Proteinen aus einem Gelfiltrations-Kalibrierungskit von Sigma  durchgeführt. Außerdem ist der übliche Aceton-Test nicht mit dem vergleichbar, was wir jetzt beobachten, da er auf einem anderen Gerät mit anderen Schläuchen durchgeführt wurde (und das kann die Auflösungsleistung erheblich beeinflussen). Wenn neue Säulen ebenfalls diese Grundlinienleckage aufweisen, dann hat GE noch Spielraum, das Säulendesign zu verbessern, und ich frage mich, um wie viel besser die Auflösung werden könnte, wenn wir die Probe kontrollierter injizieren könnten. Interessanterweise hat GE Healthcare bei diesen großen Säulen weltweit eine Monopolstellung inne (bitte korrigieren Sie mich, falls ich mich irre, da diese GE-Säulen mit einem stolzen Preis von rund 3000 € zu Buche schlagen). Bei kleineren Gelfiltrationssäulen gibt es Wettbewerb (z. B. Tosoh  ), doch außer GE Healthcare bietet niemand 60 cm (oder längere) Gelfiltrationssäulen mit einer so hohen Probenkapazität (2–5 ml) an.