Kostengünstiges PCR-basiertes Mutagenese-Kit

Wenn Sie Ihr DNA-Konstrukt modifizieren müssen, ist eine häufig verwendete Methode die PCR-basierte Mutagenese, bei der Sie die Mutation in die Mitte zweier komplementärer Primer einbauen. Alternativ können Sie für längere Insertionen einen Primer-Tag verwenden. Anschließend amplifizieren Sie einfach das gesamte Konstrukt mittels PCR. Dies funktioniert recht gut bei Konstrukten, die kleiner als ~10 kb sind. Zu diesem Zweck sind mehrere kommerzielle Kits erhältlich, die sich in den Details unterscheiden. Dazu gehören das QuickChange-Kit  von Agilent und das Q5 SDM-Kit  von NEB sowie das Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit  von ThermoFisher. Das QuikChange-Kit ist das teuerste (auch weil man es immer zusammen mit kompetenten Zellen kauft) und das NEB-Kit ist eher preisgünstig (168 € für mich hier in Finnland). Die meisten Kits sind für 10 Reaktionen ausgelegt. Aber was macht man, wenn man nur eine oder zwei Mutagenese-Reaktionen durchführen möchte? Kauft man das ganze Kit? Vor zwei Wochen stand ich vor dieser Frage. Ich ging zu unserem Enzym-Gefrierschrank und stellte fest, dass wir T4-DNA-Ligase, Polynukleotidkinase (PNK) und Phusion-Polymerase haben. Das ist alles, was man braucht, um sein eigenes Kit für die ortsspezifische Mutagenese herzustellen!

Ich habe mich an das Q5-SDM-Protokoll  gehalten. Ich habe 25 ng Template, 17 Zyklen und Phusion-Polymerase (mit HF-Puffer) anstelle des Q5-Enzyms verwendet. Meine Matrize war etwa 5500 bp lang, und ich habe zwei verschiedene Primersätze verwendet, um zwei verschiedene Mutationen zu erzeugen (eine 6-bp-Insertion und eine 21-bp-Insertion).Bei beiden Primern ist der Insertionsabschnitt einfach als Marker an das 5’-Ende eines der Primer angehängt.Die Kinase-, Ligase- und Template-Destruction-Reaktion wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt; anschließend transformierte ich selbst hergestellte kompetente E. coli-Zellen (mit einer Kompetenz von weniger als 1 Mio. KBE/µg pUC19-DNA).1 µl ungereinigtes PCR-Produkt, 0,5 µl 10x PNK-Puffer, 0,5 µl 10x T4-Ligase-Puffer, 0,5 µl 10 mM ATP, 0,5 µl T4-PNK (NEB, 10 U/µl, Haltbarkeitsdatum 9/2018)0,5 µl DpnI (NEB, 20 U/µl, Haltbarkeitsdatum 10/2000)1 µl T4-Ligase (Thermo Fisher, 5 U/µl)5,5 µl WasserFür die Kontrollreaktion habe ich den PNK-Puffer und die Ligase durch 50 % Glycerin ersetzt. Ich wollte wissen, wie viel Template den DpnI-Verdau überstehen würde. Kontrollplatte: 2 Kolonien; 6-bp-Insertion: 130 Kolonien; 10-bp-Insertion: 87 KolonienIch habe 6 Klone für die 10-bp-Insertion und 4 Klone für die 6-bp-Insertion gezüchtet. Ich führte einen Restriktionsschnitt durch, um zu überprüfen, ob die Insertionsmutagenese erfolgreich war. 3 der 4 Klone mit 6-bp-Insertion zeigten das korrekte Schnittmuster, ebenso wie 3 der 6 Klone mit 10-bp-Insertion. Außerdem habe ich die gesamte aus der PCR stammende DNA eines ausgewählten Klons für beide Mutagenese-Reaktionen sequenziert. Beide Klone wiesen eine zu 100 % korrekte Sequenz auf. Nach meinen Berechnungen und je nachdem, wie Sie die einzelnen Enzyme erworben haben, kostet diese Methode zwischen 10 und 20 % des Kit-Preises für jede einzelne Mutagenese-Reaktion (in meinem Fall etwa 3 € pro Reaktion).