Eine unmögliche Overlap-Extension-PCR

Ein Doktorand von mir fragte mich nach Plasmidkarten für mehrere DNA-Konstrukte, die ich vor etwa 20 Jahren erstellt hatte. Da es SnapGene  zu dieser Zeit noch nicht gab, hatte ich das inzwischen veraltete GeneConstructionKit2 verwendet. Ich habe damals viele Klonierungen durchgeführt, aber ich habe nicht für alle systematisch Plasmidkarten erstellt. Das GCK2-Format erlaubte leider keine einfache Annotation. Man benötigte ein separates Programm für eine umfassende Annotation der Plasmide, und diese Daten wurden in einer separaten Datei gespeichert, der sogenannten „Illustrationsdatei“: Was konnte da schon schiefgehen? Gestern habe ich schließlich meine alten Laborbücher herausgesucht und etwa 10 alte Klonierungen in SnapGene nachvollzogen. Ich war jedoch nicht in der Lage, eine der Klonierungen zu simulieren, da SnapGene das Funktionieren eines „suboptimalen“ PCR-Primers blockierte.

Ich hatte eine Overlap-Extension-PCR durchgeführt, um eine Mutation in die Maus-VEGF-D-cDNA einzuführen. Die homologe Mutation war zuvor in menschliches VEGF-D eingeführt worden, weshalb wir die Primer für die menschlichen Sequenzen hatte. Maus- und Mensch-VEGF-D sind sich sehr ähnlich. Die Primer, die für die Amplifikation der menschlichen PCR entworfen wurden, waren nicht perfekt, wenn man Maus-cDNA als Matrize verwendete, aber keiner der Unterschiede würde zu einer Änderung in der Aminosäureäsequenz führen. Also versuchte ich die PCR mit einem Primer, der eine Fehlpaarung (Mismatch) im dritten Nukleotid vom 3’-Ende aufwies. Die PCR war erfolgreich, aber selbst als ich die Hybridisierungsparameter auf die am wenigsten stringenten Einstellungen senkte, weigerte sich SnapGene, diesen Primer an das Template zu annealen.

Um die Klonierung in SnapGene zu simulieren und eine Karte zu erstellen, musste ich eine Mutation in meinen Primer einführen und die Mutation nach der Overlap-Extension-PCR wieder rückgängig machen. Ich schätze, ich muss einen Bug-Report einreichen (oder wäre das eine Feature-Anfrage?). Es erscheint angemessen, dass das Programm in der Lage sein sollte, das Annealing von Primern zuzulassen, die auch in der Realität tatsächlich annealen…