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Viele cDNA-Klone aus der ORFeome-Gensammlung liegen in einem pENTR223.1-Plasmid vor.
Bild von Michael JeltschViele cDNA-Klone aus der
ORFeome-Gensammlung
liegen im Plasmid pENTR223.1* vor. Um diese Klone zu züchten, verwenden die meisten Forscher Spectinomycin, da das Antibiotikaresistenzgen in den Karten der ORFeome-Kollaboration so bezeichnet wird und dies im Protokoll vorgeschrieben ist. Ein genauer Blick in die Literatur zeigt jedoch, dass derselbe Selektionsmarker mit Streptomycin ebenso gut funktionieren sollte. Nun, worin besteht der Unterschied? Hauptsächlich der Preis: Während 5 Gramm Spectinomycin von Sigma hier in Finnland 112,7 € kosten
(Sigma 85555-5G)
, kostet die gleiche Menge Streptomycin nur 17,80 €, also mehr als sechsmal weniger
(Sigma S6501-5G)
.Das Resistenzgen in pENTR223.1 ist das Aminoglykosid-Adenylyltransferase-Gen aadA (Streptomycin-3’’(9)-O-Nukleotidyltransferase; Aminoglykosid-3"-Adenylyltransferase (AAD(3”)(9); ANT(3”)(9)), das Resistenz sowohl gegen Spectinomycin als auch gegen Streptomycin verleiht. Es gibt jedoch verwandte Aminoglykosid-Adenylyltransferasen, die keine Resistenz gegen beide Antibiotika verleihen, sondern nur gegen das eine oder das andere. Daher müssen Sie genau wissen, welches Spektinomycin-Resistenzgen Ihr Plasmid trägt, wenn Sie Spektinomycin durch das kostengünstigere Streptomycin ersetzen möchten. Plasmidkarten sind oft nicht hilfreich: Ich habe gesehen, dass das aadA-Gen in pENTR223.1 mit SmR (Streptomycin-Resistenz, wie in SnapGene) oder SpnR (Spectinomycin-Resistenz, wie in den Karten aus der ORFeome-Sammlung) annotiert ist.Um experimentell zu prüfen, ob pENTR223.1 eine Resistenz gegen beide Antibiotika aufweist, habe ich ein Insert-haltiges pENTR223.1-Plasmid in 100 µg/ml Spectinomycin und 100 µg/ml Streptomycin gezüchtet, und es wuchs unter beiden Bedingungen gut, während der untransformierte E. coli-Elternstamm (NEB5-alpha) in keinem der beiden Medien wuchs. Allerdings sind die Unterschiede nicht immer eindeutig, wenn man verschiedene Konzentrationen dieser Antibiotika betrachtet. Aminoglykosid-Adenylyltransferasen, die Streptomycin/Spectinomycin inaktivieren, weisen bevorzugte, aber keine ausschließliche Substratspezifität auf. Das bedeutet, dass eine gewisse Resistenz gegen eine niedrige Streptomycin-Konzentration durch die Aminoglykosid-Adenylyltransferase vermittelt werden kann, die in erster Linie auf Spectinomycin abzielt (oder umgekehrt). In der Praxis sind einige von ihnen jedoch so exklusiv, dass es gerechtfertigt ist, sie entweder als SmR oder als SpnR einzustufen. Wenn Sie es wissen möchten, können Sie es jederzeit ausprobieren… Eine weitere Erkenntnis dabei war, dass der Negativselektionsmarker ccdB in XL1 Blue NICHT funktioniert, während er in NEB5-alpha sehr wohl funktioniert. Anscheinend funktioniert
ccdB auch nicht in DH5alpha und JM109
(was ist der Unterschied zwischen DH5alpha und NEB5alpha?).* pENTR-223.1 wird aufgrund der beiden SfiI-Schnittstellen, die das Insert flankieren, auch als pDONR-223.1 oder pENTR223.1-Sfi bezeichnet. Man neigt dazu, das Plasmid vor dem Einbau der cDNA als pDONR und nach dem Einbau der cDNA als pENTR zu bezeichnen. Diese Namensgebung ist jedoch nicht überall einheitlich. Nach dem Einbau des Inserts (mithilfe der Gateway-BP-Reaktion) verliert der Vektor pDONR223.1 die Selektionsmarker ccdB und chlR/CmR, und das resultierende Backbone wird meist als pENTR223.1 bezeichnet.
