Bio-Rad on Michael’s Domain

Bio-Rad repariert unser NGC

Wed, 20 Sep 2023 00:00:00 +0000

UPDATE (Stand: 21. Dezember 2024)

Wir haben gerade unseren Kurs zur Proteinreinigung (DPDR-305) hinter uns gebracht (siehe auch meine anderen blog posts über Lehre ). Nachdem wir etwa 25 Aufreinigungen mit dem „reparierten“ Bio-Rad NGC durchgeführt haben, muss ich leider feststellen, dass das größte Problem weiterhin besteht: Das FPLC reagiert nicht mehr auf manuell eingegebene Befehle. Auch die zufälligen Verbindungsabbrüche hielten an. Zwar hatte nur eine Studentengruppe Probleme, doch kam es an diesem einen Tag zu mehreren Vorfällen. Damit endet leider unser kurzer Ausflug in das Bio-Rad-Territorium der Proteinreinigung. All dies deutet darauf hin, dass weitere Investitionen in dieses Gerät reine Zeit- und Geldverschwendung wären. Wir haben weder zu viel Zeit noch zu viel Geld. Wenn Bio-Rad aus eigener Initiative etwas unternehmen möchte, bin ich gerne bereit, ihnen alle notwendigen Maßnahmen zu überlassen, um das Gerät in einen nutzbaren Zustand zu versetzen, aber wir werden keine weiteren Schritte aktiv verfolgen. Der beste Weg, Ihr FPLC-Gerät in gutem Zustand zu halten, ist ein Wartungsvertrag. Obwohl wir in den letzten 30 Jahren zweimal Mittel von unserer Universität erhalten haben, um ein FPLC-Gerät der Spitzenklasse anzuschaffen, ist es viel schwieriger, Mittel für einen Wartungsvertrag zu bekommen. Einer der vielen Gründe dafür ist, dass die meisten Förderzeiträume kürzer sind als Wartungsverträge, die nur dann Sinn machen, wenn sie über mehrere Jahre abgeschlossen werden.

Showdown: „Äkta“ von GE Healthcare gegen „NGC“ von Bio-Rad

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Seit 1996 beschäftige ich mich mit der Reinigung von Proteinen. Bis 2015 arbeitete ich mit einem Äkta Explorer, dann haben wir auf den Äkta Avant umgestellt. Im Jahr 2020 zog mein Labor um, und wir erhielten einen Bio-Rad NGC , den wir nun seit zwei Jahren nutzen.Wir hatten viele Probleme mit dem Bio-Rad NGC. Zunächst dachte ich, dass dies beim Systemwechsel vielleicht normal sei. Ich ging davon aus, dass die Probleme nach und nach verschwinden würden. Schließlich hatten wir auch Probleme, als wir vom Explorer auf den Avant umgestiegen sind.Doch selbst nach zwei Jahren und Dutzenden von Aufreinigungsläufen scheinen die Probleme mit dem NGC nicht aufzuhören. Immer wenn wir ein Problem lösen, taucht ein neues, bisher unbekanntes Problem auf. Und im Gegensatz zu GE Healthcare ist der Kundenservice von Bio-Rad nicht einmal annähernd so gut wie der, den wir von GE Healthcare gewohnt sind. Als unsere IT-Abteilung den Äkta nicht mit dem Netzwerk unserer Universität verbinden konnte, schickte GE Healthcare einen Techniker aus ihrem Münchner Team nach Helsinki, um das Problem zu beheben. In Anbetracht der Einarbeitungszeit bot GE Healthcare außerdem einem Mitarbeiter aus unserem Team die kostenlose Teilnahme an einem ihrer Kurse an. Und ihr Support beschränkte sich nicht auf die Garantiezeit! Sie wollten wirklich, dass wir mit ihrem Gerät zufrieden sind. Von Bio-Rad erfahren wir nicht das gleiche Maß an Unterstützung. Es fühlt sich immer so an, als müssten wir sie dazu zwingen, die Probleme zu lösen, die wir mit dem NGC haben, und ihre Reaktionszeit liegt weit unter jeglichen Kundenerwartungen.Dies ist der erste von mehreren Blogbeiträgen zum Thema „Äkta versus NGC“. Ich hoffe, dass ich in den nächsten Monaten die Zeit finden werde, ausführlicher über all unsere Probleme zu berichten.Wir haben 2015 beschlossen, dass wir endlich ein neues FPLC brauchten. Unser Äkta Explorer näherte sich dem Ende seiner Lebensdauer, und wir hatten rund 100.000 Fördermittel erhalten, um das FPLC unserer Zentraleinrichtung zu erneuern. Das Gerät war so teuer, dass wir das offizielle Ausschreibungsverfahren durchlaufen mussten (damals lag die Obergrenze bei 30.000 €, inzwischen wurde sie jedoch auf 60.000 € angehoben). Es gab nur zwei Mitbewerber: den Bio-Rad Discover NGC und den GE Healthcare Äkta Avant. Das Bio-Rad-Gerät war günstiger (82.810 € gegenüber 95.470 €), doch wir entschieden uns für den Kauf des Geräts von GE Healthcare. Ein wichtiger Grund dafür war, dass alle unsere Nutzer bisher den Äkta Explorer und dessen Unicorn-Software verwendet hatten. Ein Wechsel wäre einfach zu störend gewesen und hätte viel Unterstützung und Zeit unsererseits erfordert. Es gab jedoch auch technische Gründe, die uns dazu veranlassten, den Äkta dem NGC vorzuziehen: Vorteile des Äkta Avant

Testbericht zum Äkta Avant 25 von GE Healthcare

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Vor etwa einem Jahr haben wir im Rahmen einer internen Ausschreibung der Fakultät Fördermittel erhalten, um das alte Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC-Gerät der Zentrale Einrichtung für Proteinproduktion und -reinigung zu ersetzen. Der Äkta Explorer war 1996(?) angeschafft worden, als die schwedische Marke Pharmacia noch existierte. Im Jahr 2014 trat das Worst-Case-Szenario ein: Sowohl der Monochromator als auch Xenon-Blitzlampe fast gleichzeitig ausfielen, was uns eine Rechnung von fast 10.000 € bescherte. Daher wollten wir das Gerät durch ein modernes Modell ersetzen. Es gibt nur zwei Unternehmen, die in diesem Bereich seriöse Geräte anbieten, nämlich GE Healthcare ( Äkta-Produktreihe ) und BioRad ( NGC-Produktreihe ). GE Healthcare hat die Marke Äkta im Zuge mehrerer Fusionen von Pharmacia übernommen, während BioRad mit seinen NGC-Modellen, die erst vor wenigen Jahren auf den Markt kamen, ein relativ neuer Wettbewerber ist.Wir haben uns für das Äkta Avant 25 entschieden. Wir wollten auf jeden Fall einen gekapselten, gekühlten Fraktionssammler haben. Außerdem war uns eine vertraute Benutzererfahrung wichtig. Wir führen häufig automatisierte Aufreinigungen durch und möchten nicht, dass unsere Proteine längere Zeit bei Raumtemperatur in offenen Röhrchen stehen, in die Bakterien und Staub aus der Luft eindringen können. Mittlerweile setzen wir den Äkta Avant seit etwa einem halben Jahr ein und haben inzwischen einen guten Eindruck davon, wie er im Vergleich zum Äkta Explorer abschneidet. Obwohl der Avant moderner ist als der Explorer, nutzen alle Anwender unserer Zentraleinrichtung nach wie vor den Explorer. Sie sind mit der Benutzeroberfläche von Unicorn 5.11 vertraut und haben offenbar kein Interesse daran, sich in die – zugegebenermaßen – kompliziertere Benutzeroberfläche des Avant einzuarbeiten. Ein weiterer Grund dafür, dass das Gerät bisher nur intern genutzt wurde, war jedoch die beträchtliche Anzahl an Problemen, auf die wir gestoßen sind. Bei unserem alten Äkta Explorer haben wir noch nie so viele Probleme in so kurzer Folge erlebt. Ich weiß nicht, ob unsere Situation typisch ist (laut den Vertretern von GE Healthcare ist dies nicht der Fall). Dennoch sind hier die Probleme aufgeführt, auf die wir gestoßen sind:

Neon-Elektroporationsgerät versagt

Tue, 04 Aug 2015 00:00:00 +0000

UPDATE: Wir sind nicht die Einzigen, die versuchen, ihre Betriebskosten zu senken. Dieses Labor hat seine Experimente mit dem Neon-System in Analytic Biochemistry veröffentlicht. Vielen Dank an Joachim Goedhart ( @joachimgoedhart ) für den Hinweis! Das Neon-Transfektionsgerät von Life Technologies (ups, heute Thermo Fischer und früher Invitrogen ) wurde vor etwa fünf Jahren auf den Markt gebracht. Es ist für die einfache Elektroporation von Säugetierzellen konzipiert. Wir verfügen seit 2011 über das Gerät, aber es wurde kaum genutzt. Ich weiß nicht, ob die geringe Akzeptanz an der Benutzerunfreundlichkeit liegt (ich weiß immer noch nicht, wie man die Elektrodenspitze an die Pipette ansetzt, obwohl ich das schon hunderte Male gemacht habe – es ist einfach eine sehr knifflige Mechanik), an den hohen Betriebskosten (für die vergoldeten Einwegelektroden und den proprietären Transfektionspuffer) oder an etwas anderem, das ich nicht herausfinden kann. Es gibt jedoch ein paar Dinge, die ich gerne teilen möchte, da wirklich nützliche Informationen über das Neon-Gerät im Internet rar sind.Das erste Problem, mit dem wir ständig zu kämpfen hatten, waren Luftblasen in der Elektrodenspitze, die zu katastrophal niedrigen Elektroporationseffizienzen führen. Die einzige Möglichkeit, dies wirklich zu verhindern, besteht darin, mindestens 25 % mehr Zellsuspension vorzubereiten, als tatsächlich benötigt wird. Wenn man nur 10 % mehr ansetzt, kommt es bei der letzten Elektroporation aufgrund unvermeidbarer Luftblasen mit Sicherheit zu Lichtbogenbildung (außerdem haftet die Zellsuspension leicht an der Außenseite der Pipettenspitze, was ebenfalls dazu beiträgt, dass man mehr ansetzen muss, als tatsächlich benötigt wird). Infolgedessen ging uns der Elektroporationspuffer R lange vor den Pipettenspitzen aus. Zudem kann man Puffer R nicht separat erwerben. Der Vertreter von Life Technologies, mit dem ich korrespondierte, versprach uns aus Kulanz eine kleine Lieferung Pipettenspitzen und Puffer zu schicken (das war im Januar), aber wir warten immer noch darauf, dass diese eintrifft…Leider ist kürzlich unser altes Elektroporationsgerät Gene Pulser II kaputt gegangen. Bio-Rad repariert es nicht mehr und liefert auch keine Ersatzteile mehr. Es wurde hauptsächlich für die Elektroporation von E. coli verwendet. Ich wusste, dass das Neon-Gerät nicht für die Elektroporation von E. coli ausgelegt ist. Warum nicht und warum kann es nicht für diesen Zweck verwendet werden? Es stellt sich heraus, dass die elektrische Feldstärke für E. coli bei weitem nicht ausreicht (beim BioRad Gene Pulser II wird bei einer typischen bakteriellen Elektroporation ein elektrisches Feld von 12,5 kV/cm erreicht, während das Neon-Gerät gerade einmal etwa 850 V/cm erreicht). Allerdings (so dachte ich), kann das Neon viel längere Impulse erzeugen als der Gene Pulser II (das Neon wird damit beworben, Impulse von bis zu 100 ms liefern zu können, während die typische Impulslänge des Gene Pulser II bei etwa 5 ms liegt). Darüber hinaus kann das Neon automatisch mehrere Impulse abgeben. Deshalb wollte ich testen, ob ein langer und/oder wiederholter Impuls mit geringerer Feldstärke E. coli transformieren kann. Es stellte sich jedoch heraus, dass das Gerät, wenn man Wasser (oder 10 % Glycerin) als Transfektionspuffer für E. coli verwendet (was üblicherweise der Fall ist), meldet, dass die Spitzenelektrode keinen Kontakt herstellt. Dies liegt daran, dass das Gerät durch das Senden eines kleinen Stroms durch das System prüft, ob die Spitze korrekt eingesetzt wurde, und dieser Strom nicht fließt, wenn man E. coli in Wasser resuspendiert hat. Damit das Gerät eine eingesetzte Pipettenspitze als Elektrode „akzeptiert“, benötigt man eine NaCl-Konzentration zwischen 10 und 20 mM. Daher habe ich 15 mM Natriumchlorid als E. coli-Elektroporationspuffer verwendet und die Elektroporationsparameter auf 2500 V und 100 ms eingestellt. Überraschung: Das Gerät weigert sich, einen solchen Impuls abzugeben, da es „Over power limit!“ anzeigt. Die maximale Impulsdauer, die es bei 2500 V liefern kann, beträgt 19 ms. Leider kann selbst dieser Impuls nicht automatisch mehrfach abgegeben werden (wieder: „Over power limit!“). Daher habe ich diesen Impuls manuell zwischen 1 und 20 Mal ausgelöst, aber kein einziges Bakterium hat DNA aufgenommen, und alle Bakterienplatten blieben leer. In der Bedienungsanleitung heißt es: „Das Neon™-Gerät ist so ausgelegt, dass nur bestimmte Werte eingegeben werden können; die Grenzwerte für jeden Wert sind unten aufgeführt. Wenn Ihr Eingabewert den Maximalwert überschreitet, wird eine Fehlermeldung angezeigt. Eingangsspannungsbereich: 500–2.500 V Eingangsimpulsbreitenbereich: 1–100 ms Eingangsimpulsanzahlbereich: 1–10“ Leider kann dies sehr leicht missverstanden werden. Mir war nicht klar, dass man die drei Parameter innerhalb dieser Bereiche nicht beliebig kombinieren kann. Man sollte meinen, dass Life Technologies über bessere technische Redakteure verfügt (aber vielleicht benutzen sie das Gerät ja gar nicht …). Fazit: Das Gerät ist für alles andere als Säugetierzellen völlig unbrauchbar. Auch einige andere interessante Anwendungen (z. B. die Elektroporation von Fadenwürmern oder anderen kleinen Lebewesen) sind schwierig oder unmöglich. Das Gerät mag zwar für viele Säugetierzellen eine gute Wahl sein, ist aber weitaus eingeschränkter als der altbewährte BioRad Gene Pulser II. P.S.: Ich habe die Pipettierstation mit Puffer E befüllt (zur Verwendung mit 10-µl-Spitzen). Allerdings habe ich statt Puffer E auch eine Mischung aus 90 % 150 mM Natriumchlorid und 10 % Glycerin getestet (die mir die gleiche Leitfähigkeit wie Puffer E liefert). Dennoch würde ich wirklich gerne die Zusammensetzung von Puffer R wissen. Warum? Weil ich glaube, dass die Spitzenelektroden öfter als nur zweimal wiederverwendet werden können (andere Hersteller von Pipettenspitzenelektroden werben damit, dass ihre Elektroden viel öfter wiederverwendet werden können (z. B. der BactoZapper , obwohl auch sie keine genauen Zahlen nennen). Im Neon-Handbuch heißt es: „Bei mehr als zweimaligem Gebrauch der Spitzen kann es zur Oxidbildung an der Kolbenoberfläche kommen, was die Elektrodenfunktion des Kolbens beeinträchtigt.“ Die Elektrode ist vergoldet, und Gold sollte widerstandsfähiger gegen Oxidbildung sein als die Edelstahlelektroden des BactoZapper…