Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Wir organisieren (erneut) einen praxisorientierten Kurs zur Proteinreinigung vom 4. bis zum 20. Dezember. Wir können maximal 16 Teilnehmer aufnehmen, die in Gruppen von 2 bis 4 Teilnehmern eingeteilt werden. Jede Gruppe benötigt drei volle Tage, um die praktischen Übungen durchzuführen, wobei sich der dritte Tag des Kurses mit dem ersten Tag der nächsten Gruppe überschneidet. Veranstaltungsort ist das Biomedicum Helsinki, Räume A516a1 (wo sich die Geräte befinden) und B318a/b (unser Labor). Wir werden ein Protein (VEGF-Rezeptor 3) mithilfe eines zweistufigen Protokolls (Affinitätschromatographie + Gelfiltration) auf dem Äkta Avant FPLC-Gerät aufreinigen. Am dritten Kurstag werden wir die Wechselwirkung dieses Proteins mit seinem Liganden (VEGF-C) auf dem ITC-Gerät (isotherme Kalorimetrie) untersuchen. Wir haben bereits 2015 einen ähnlichen Kurs angeboten ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Dieser neue Kurs ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) wird einen ähnlichen Aufbau haben, wir erweitern ihn jedoch um einen Tag, um Protein-Wechselwirkungen mithilfe des neuen Isothermischen-Kalorimetrie-Geräts unserer B3P-Kernanlage zu analysieren. Die Dokumentation und die Ergebnisse werden ebenfalls hier verfügbar sein.Da wir maximal zwei Proben gleichzeitig bearbeiten können (wir verfügen „nur“ über zwei FPLC-Geräte), müssen wir die Teilnehmer in Gruppen (mit jeweils 2–4 Studierenden) aufteilen und den dreitägigen Kurs je nach Teilnehmerzahl mehrmals wiederholen.

Leistung der HiLoad 26/60 Superdex PG-Gelfiltrationschromatographie-Säule

Mon, 11 Apr 2016 00:00:00 +0000

Die von uns am häufigsten verwendete Technik zur Proteinreinigung ist die Gelfiltration (auch als Größenausschlusschromatographie bezeichnet). Bei der Gelfiltration werden Proteine nach ihrer Größe getrennt (genauer gesagt nach ihrem „Stokes-Radius“, der weitgehend von ihrer Größe und Form bestimmt wird). Für die Gelfiltration großer Proteinmengen haben wir vor etwa 9 Jahren die HiLoad 26/60 Superdex 200 Prep Grade von GE Healthcare erworben (das Modell 26/60 wurde inzwischen durch das HiLoad 26/600 ersetzt, beide sind jedoch nahezu identisch). Mit dieser Säule lassen sich zwei Proteine, deren Größenunterschied 100 % beträgt, sehr sauber trennen. Daher eignet sie sich zur Trennung von monomeren und dimeren Formen desselben Proteins. Das „Verfallsdatum“ der Säule war März 2012. Nach unserer Erfahrung kann eine solche Säule bei sachgemäßer Handhabung problemlos eine Lebensdauer von 10 bis 15 Jahren erreichen (wir verwenden sie nicht sehr oft, lagern sie in 20 %igem Ethanol und bewahren sie bei +4 °C auf, wenn wir sie über längere Zeit nicht benötigen).

FPLC-Kurs zur Proteinreinigung

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Acht Doktoranden hatten sich für den FPLC-Kurs zur Proteinreinigung angemeldet, der im Dezember stattfand. Wenn ich etwas gelernt habe, dann, dass die Proteinreinigung im Rahmen eines Kurses IMMER mit einem Protein und einem Protokoll durchgeführt werden sollte, die bereits VIELE Male erfolgreich angewendet wurden. Von den Studierenden mitgebrachte Proteine sind eine hervorragende Lernquelle, doch die zeitlichen Einschränkungen eines Kursformats erlaubten es uns nicht, die Aufreinigung dieser Proteine noch während des Kurses abzuschließen.Technische Probleme mit dem neuen Äkta Avant 25Zudem war das Äkta Avant 25 , die wir diesen Sommer neu bei GE Healthcare erworben hatten, fiel während des Kurses ZWEIMAL aus. Zunächst fiel der Steuerungscomputer aus (RAID-Ausfall). HP lieferte die Ersatzfestplatte innerhalb von 24 Stunden, und nachdem sich das RAID wiederhergestellt hatte, konnten wir den Kurs fortsetzen. Beim ersten Durchlauf nach diesem Vorfall trat beim Äkta jedoch ein Überdruckproblem auf. Wir identifizierten einen defekten Durchflussbegrenzer als Ursache identifiziert, wollten den Lauf jedoch nicht fortsetzen, da wir bei früheren Durchläufen bereits schwerwiegende Probleme mit Luftblasen hatten. Daher führten wir die Durchläufe auf dem alten Äkta Explorer 100 durch. GE Healthcare ließ das System umgehend von einem Servicetechniker überprüfen, doch da dieser kein Ersatzgerät dabei hatte, mussten wir bis Montag, den 14.12., warten, bis der Äkta Avant wieder voll funktionsfähig war.Was wir aufgereinigt haben: lösliches VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) und HepsinWir haben lösliches humanes VEGF-Rezeptor-3 aufgereinigt (die ersten drei Domänen seiner extrazellulären Domäne, verbunden mit dem konstanten Fc-Teil von humanem IgG). Diese Aufreinigung haben wir bereits mehrfach durchgeführt. Sie entspricht der Aufreinigung von Antikörpern mit Protein-A-Sepharose.Wir hatten im Vorfeld konditioniertes Zellkulturmedium vorbereitet. Wir produzieren die meisten unserer Proteine in Insektenzellen (hauptsächlich Drosophila S2), und das VEGFR-3/Fc war von den S2-Zellen nach Induktion des Metallothionein-Promotors mit 1 mM Cu²⁺ über etwa 4,5 Tage hinweg in das Medium sekretiert worden. Die Vorbereitung des Mediums für die Aufreinigung besteht lediglich aus 1) dem Entfernen der Zellen durch Zentrifugation und 2) der Filtration, um Präzipitate und andere kleine Partikel zu entfernen, die die Säule verstopfen könnten. Eine Anpassung des pH-Werts ist nicht erforderlich.Eine schnelle Neutralisierung nach der Elution bei niedrigem pH-Wert IST WICHTIGWir haben das Medium über eine Einweg-5-ml- HiTrap-Rekombinant-Protein-A-Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von etwa 1 ml/min und eluierten es mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Die eluierten 2-ml-Fraktionen wurden sofort mit 400 µl 1 M Tris (pH 8,5) neutralisiert. Hier unterlief uns bei einer der beiden Aufreinigungen ein kleiner Fehler. GE Healthcare hatte die Kassetten für die 5-ml-Sammelröhrchen noch nicht freigegeben (dies ist bis heute nicht geschehen, obwohl sie bereits für September 2015 versprochen worden waren), und wir verwendeten 15-ml-Falcon-Röhrchen zur Sammlung der 2-ml-Fraktionen, in die wir zuvor 400 µl der Neutralisationslösung alikvotiert hatten. Allerdings war die Durchmischung in diesen Röhrchen nicht effizient, und die längere Einwirkung eines niedrigen pH-Werts führte zu einer teilweisen Schädigung unseres Proteins. Dies lässt sich beim Vergleich der Größenausschluss-Chromatogramme von Gruppe 2 mit denen von Gruppe 4 erkennen: Bei Gruppe 4 ist der erste Peak (aggregiertes Protein) im Vergleich zum entsprechenden Peak bei Gruppe 2 deutlich größer und heterogener. Tatsächlich fällt VEGFR-3/Fc, wenn es bei niedrigem pH-Wert aus Protein-A-Säulen eluiert wird, bei höheren Konzentrationen kurz nach der Elution stets aus, löst sich jedoch bei Neutralisation wieder auf. Dies geschah in den Fraktionen 5.A.3 und 5.A.4 (Gruppe 4) nicht, da sich Eluat und Neutralisationspuffer im 15-ml-Falcon-Röhrchen nicht ausreichend vermischten (wahrscheinlich trug auch die Fraktionsgröße von 2 ml dazu bei; 1 ml wäre besser gewesen). Während des Laufs für Gruppe 2 haben wir die Röhrchen unmittelbar nach Beendigung des Laufs entnommen und dadurch die Puffer vermischt, während der Lauf für Gruppe 4 über Nacht endete und das Eluat bis zum Morgen weitgehend unvermischt blieb.Alternativ hätten wir mit einem hochkonzentrierten chaotropen Salz bei nahezu neutralem pH-Wert eluieren können (was wir beim nächsten Mal tun werden, falls wir einen automatisierten Lauf haben, bei dem die Elution mitten in der Nacht stattfindet). Pierce bietet einen (proprietären) „sanften“ Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 6,6 an. Ich kenne die Zusammensetzung des Pierce-Puffers nicht, aber es handelt sich um eine hochkonzentrierte Lösung eines chaotropen Salzes. 3 M Kalium-/Natriumthiocyanat oder 4 M Magnesiumchlorid in gepufferten Lösungen um pH 7 sind häufig verwendete chaotrope Salze für diesen Zweck. Hepsin Die von den Studierenden bereitgestellten Proteine stellten eine Herausforderung dar. Erstens war ihre Konzentration im Ausgangsmaterial sehr gering. Während wir das Protein deutlich erkennen können, wenn das VEGFR-3/Fc-konditionierte Medium auf einem PAGE-Gel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt wird, ist für das Hepsin kein solches Band sichtbar. Zudem schien ein erheblicher Anteil des Proteins das Histag (nicht mehr) zu enthalten und wird daher im ersten Reinigungsschritt nicht aufgefangen. Der Anteil an Hepsin-H6, der an Ni²⁺-Sepharose bindet, eluiert bereits bei einer Imidazol-Konzentration von 20 mM, was das Waschen der Säule erschwert. Das Hepsin mit dem längeren Histag (H10) übersteht die 20 mM Imidazol-Waschung zwar, weist jedoch ebenfalls niedrige Expressionsniveaus auf. Nachfolgend sind die Chromatogramme der einzelnen Durchläufe sowie die kommentierten Bilder der mit Coomassie gefärbten PAGE-Gele dargestellt. Das detaillierte Protokoll für den Betrieb des Äkta Avant 25 befindet sich noch in Vorbereitung…

Chromatographie on Michael’s Domain

Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine

Leistung der HiLoad 26/60 Superdex PG-Gelfiltrationschromatographie-Säule

FPLC-Kurs zur Proteinreinigung