E. Coli on Michael’s Domain

Bioaktives VEGF-C aus E. coli ohne In-vitro-Faltung!

Fri, 28 Oct 2022 00:00:00 +0000

Unser Artikel „Bioaktives VEGF-C aus E. coli“ wurde in Scientific Reports veröffentlicht. Hier lesen: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22960-0.As Tatsächlich habe ich bereits 1999 die ersten Experimente zur Expression von VEGF-C in E. coli durchgeführt, jedoch nie aktives Protein erhalten. In den folgenden mehr als 15 Jahren verwendeten wir ausschließlich eukaryotische Zellen (Hefe, S2/Sf9/Hi5-Insektenzellen, CHO) zur Herstellung von VEGF-C. Vor einigen Jahren haben wir das Projekt „VEGF-C in E. coli“ wieder aufgenommen und unser Ziel schließlich im letzten Jahr erreicht. Allerdings war der Aufwand viel größer, als wir ursprünglich erwartet hatten. Zu Beginn schlugen alle Versuche fehl, und um das Projekt zu retten, entwickelten wir ein In-vitro-Faltungsprotokoll. Es war vielleicht eher Glück als Können, dass wir zufällig auf eine Kombination aus Solubilitäts-Tag und einem redoxmodifizierten E. coli-Stamm stießen, mit der es gelang, direkt bioaktives VEGF-C zu produzieren, ohne dass ein In-vitro-Faltungsschritt erforderlich war. Wir haben uns entschlossen, auch unsere erfolglosen Versuche (CyDisCo und periplasmatische Expression) in den Abschnitt „Ergebnisse“ aufzunehmen, um den „File-Drawer-Effekt“ zu vermeiden.

„Bioaktives VEGF-C aus dem Zytoplasma von E. coli“ – Preprint online

Fri, 01 Jul 2022 00:00:00 +0000

Der Preprint unseres Manuskripts ist online verfügbar. Wir zeigen, wie man bioaktives, reifes VEGF-C im Zytoplasma von E. coli-Bakterien herstellen kann, ohne dass ein Faltungsschritt erforderlich ist. Es hat eine ganze Weile gedauert, bis wir dieses Ergebnis erreicht haben, und wir haben viele Dinge ausprobiert, die nicht funktioniert haben, bevor wir einen Weg gefunden haben, wie es geht. Wir beschreiben auch die Methoden, die gescheitert sind. Es sieht so aus, als hätte VEGF-C einfach zu viele Cysteinreste, die sich alle in der richtigen Konfiguration paaren müssen. Im selben Manuskript berichten wir auch über eine praktikable Methode zur Rückfaltung. Schaut doch mal rein und gebt uns Feedback: https://www.researchsquare.com/article/rs-1776636/v1 .

Neon-Elektroporationsgerät versagt

Tue, 04 Aug 2015 00:00:00 +0000

UPDATE: Wir sind nicht die Einzigen, die versuchen, ihre Betriebskosten zu senken. Dieses Labor hat seine Experimente mit dem Neon-System in Analytic Biochemistry veröffentlicht. Vielen Dank an Joachim Goedhart ( @joachimgoedhart ) für den Hinweis! Das Neon-Transfektionsgerät von Life Technologies (ups, heute Thermo Fischer und früher Invitrogen ) wurde vor etwa fünf Jahren auf den Markt gebracht. Es ist für die einfache Elektroporation von Säugetierzellen konzipiert. Wir verfügen seit 2011 über das Gerät, aber es wurde kaum genutzt. Ich weiß nicht, ob die geringe Akzeptanz an der Benutzerunfreundlichkeit liegt (ich weiß immer noch nicht, wie man die Elektrodenspitze an die Pipette ansetzt, obwohl ich das schon hunderte Male gemacht habe – es ist einfach eine sehr knifflige Mechanik), an den hohen Betriebskosten (für die vergoldeten Einwegelektroden und den proprietären Transfektionspuffer) oder an etwas anderem, das ich nicht herausfinden kann. Es gibt jedoch ein paar Dinge, die ich gerne teilen möchte, da wirklich nützliche Informationen über das Neon-Gerät im Internet rar sind.Das erste Problem, mit dem wir ständig zu kämpfen hatten, waren Luftblasen in der Elektrodenspitze, die zu katastrophal niedrigen Elektroporationseffizienzen führen. Die einzige Möglichkeit, dies wirklich zu verhindern, besteht darin, mindestens 25 % mehr Zellsuspension vorzubereiten, als tatsächlich benötigt wird. Wenn man nur 10 % mehr ansetzt, kommt es bei der letzten Elektroporation aufgrund unvermeidbarer Luftblasen mit Sicherheit zu Lichtbogenbildung (außerdem haftet die Zellsuspension leicht an der Außenseite der Pipettenspitze, was ebenfalls dazu beiträgt, dass man mehr ansetzen muss, als tatsächlich benötigt wird). Infolgedessen ging uns der Elektroporationspuffer R lange vor den Pipettenspitzen aus. Zudem kann man Puffer R nicht separat erwerben. Der Vertreter von Life Technologies, mit dem ich korrespondierte, versprach uns aus Kulanz eine kleine Lieferung Pipettenspitzen und Puffer zu schicken (das war im Januar), aber wir warten immer noch darauf, dass diese eintrifft…Leider ist kürzlich unser altes Elektroporationsgerät Gene Pulser II kaputt gegangen. Bio-Rad repariert es nicht mehr und liefert auch keine Ersatzteile mehr. Es wurde hauptsächlich für die Elektroporation von E. coli verwendet. Ich wusste, dass das Neon-Gerät nicht für die Elektroporation von E. coli ausgelegt ist. Warum nicht und warum kann es nicht für diesen Zweck verwendet werden? Es stellt sich heraus, dass die elektrische Feldstärke für E. coli bei weitem nicht ausreicht (beim BioRad Gene Pulser II wird bei einer typischen bakteriellen Elektroporation ein elektrisches Feld von 12,5 kV/cm erreicht, während das Neon-Gerät gerade einmal etwa 850 V/cm erreicht). Allerdings (so dachte ich), kann das Neon viel längere Impulse erzeugen als der Gene Pulser II (das Neon wird damit beworben, Impulse von bis zu 100 ms liefern zu können, während die typische Impulslänge des Gene Pulser II bei etwa 5 ms liegt). Darüber hinaus kann das Neon automatisch mehrere Impulse abgeben. Deshalb wollte ich testen, ob ein langer und/oder wiederholter Impuls mit geringerer Feldstärke E. coli transformieren kann. Es stellte sich jedoch heraus, dass das Gerät, wenn man Wasser (oder 10 % Glycerin) als Transfektionspuffer für E. coli verwendet (was üblicherweise der Fall ist), meldet, dass die Spitzenelektrode keinen Kontakt herstellt. Dies liegt daran, dass das Gerät durch das Senden eines kleinen Stroms durch das System prüft, ob die Spitze korrekt eingesetzt wurde, und dieser Strom nicht fließt, wenn man E. coli in Wasser resuspendiert hat. Damit das Gerät eine eingesetzte Pipettenspitze als Elektrode „akzeptiert“, benötigt man eine NaCl-Konzentration zwischen 10 und 20 mM. Daher habe ich 15 mM Natriumchlorid als E. coli-Elektroporationspuffer verwendet und die Elektroporationsparameter auf 2500 V und 100 ms eingestellt. Überraschung: Das Gerät weigert sich, einen solchen Impuls abzugeben, da es „Over power limit!“ anzeigt. Die maximale Impulsdauer, die es bei 2500 V liefern kann, beträgt 19 ms. Leider kann selbst dieser Impuls nicht automatisch mehrfach abgegeben werden (wieder: „Over power limit!“). Daher habe ich diesen Impuls manuell zwischen 1 und 20 Mal ausgelöst, aber kein einziges Bakterium hat DNA aufgenommen, und alle Bakterienplatten blieben leer. In der Bedienungsanleitung heißt es: „Das Neon™-Gerät ist so ausgelegt, dass nur bestimmte Werte eingegeben werden können; die Grenzwerte für jeden Wert sind unten aufgeführt. Wenn Ihr Eingabewert den Maximalwert überschreitet, wird eine Fehlermeldung angezeigt. Eingangsspannungsbereich: 500–2.500 V Eingangsimpulsbreitenbereich: 1–100 ms Eingangsimpulsanzahlbereich: 1–10“ Leider kann dies sehr leicht missverstanden werden. Mir war nicht klar, dass man die drei Parameter innerhalb dieser Bereiche nicht beliebig kombinieren kann. Man sollte meinen, dass Life Technologies über bessere technische Redakteure verfügt (aber vielleicht benutzen sie das Gerät ja gar nicht …). Fazit: Das Gerät ist für alles andere als Säugetierzellen völlig unbrauchbar. Auch einige andere interessante Anwendungen (z. B. die Elektroporation von Fadenwürmern oder anderen kleinen Lebewesen) sind schwierig oder unmöglich. Das Gerät mag zwar für viele Säugetierzellen eine gute Wahl sein, ist aber weitaus eingeschränkter als der altbewährte BioRad Gene Pulser II. P.S.: Ich habe die Pipettierstation mit Puffer E befüllt (zur Verwendung mit 10-µl-Spitzen). Allerdings habe ich statt Puffer E auch eine Mischung aus 90 % 150 mM Natriumchlorid und 10 % Glycerin getestet (die mir die gleiche Leitfähigkeit wie Puffer E liefert). Dennoch würde ich wirklich gerne die Zusammensetzung von Puffer R wissen. Warum? Weil ich glaube, dass die Spitzenelektroden öfter als nur zweimal wiederverwendet werden können (andere Hersteller von Pipettenspitzenelektroden werben damit, dass ihre Elektroden viel öfter wiederverwendet werden können (z. B. der BactoZapper , obwohl auch sie keine genauen Zahlen nennen). Im Neon-Handbuch heißt es: „Bei mehr als zweimaligem Gebrauch der Spitzen kann es zur Oxidbildung an der Kolbenoberfläche kommen, was die Elektrodenfunktion des Kolbens beeinträchtigt.“ Die Elektrode ist vergoldet, und Gold sollte widerstandsfähiger gegen Oxidbildung sein als die Edelstahlelektroden des BactoZapper…

Resistenz gegen Streptomycin und Spectinomycin

Sun, 11 Jan 2015 00:00:00 +0000

Viele cDNA-Klone aus der ORFeome-Gensammlung liegen im Plasmid pENTR223.1* vor. Um diese Klone zu züchten, verwenden die meisten Forscher Spectinomycin, da das Antibiotikaresistenzgen in den Karten der ORFeome-Kollaboration so bezeichnet wird und dies im Protokoll vorgeschrieben ist. Ein genauer Blick in die Literatur zeigt jedoch, dass derselbe Selektionsmarker mit Streptomycin ebenso gut funktionieren sollte. Nun, worin besteht der Unterschied? Hauptsächlich der Preis: Während 5 Gramm Spectinomycin von Sigma hier in Finnland 112,7 € kosten (Sigma 85555-5G) , kostet die gleiche Menge Streptomycin nur 17,80 €, also mehr als sechsmal weniger (Sigma S6501-5G) .Das Resistenzgen in pENTR223.1 ist das Aminoglykosid-Adenylyltransferase-Gen aadA (Streptomycin-3’’(9)-O-Nukleotidyltransferase; Aminoglykosid-3"-Adenylyltransferase (AAD(3”)(9); ANT(3”)(9)), das Resistenz sowohl gegen Spectinomycin als auch gegen Streptomycin verleiht. Es gibt jedoch verwandte Aminoglykosid-Adenylyltransferasen, die keine Resistenz gegen beide Antibiotika verleihen, sondern nur gegen das eine oder das andere. Daher müssen Sie genau wissen, welches Spektinomycin-Resistenzgen Ihr Plasmid trägt, wenn Sie Spektinomycin durch das kostengünstigere Streptomycin ersetzen möchten. Plasmidkarten sind oft nicht hilfreich: Ich habe gesehen, dass das aadA-Gen in pENTR223.1 mit SmR (Streptomycin-Resistenz, wie in SnapGene) oder SpnR (Spectinomycin-Resistenz, wie in den Karten aus der ORFeome-Sammlung) annotiert ist.Um experimentell zu prüfen, ob pENTR223.1 eine Resistenz gegen beide Antibiotika aufweist, habe ich ein Insert-haltiges pENTR223.1-Plasmid in 100 µg/ml Spectinomycin und 100 µg/ml Streptomycin gezüchtet, und es wuchs unter beiden Bedingungen gut, während der untransformierte E. coli-Elternstamm (NEB5-alpha) in keinem der beiden Medien wuchs. Allerdings sind die Unterschiede nicht immer eindeutig, wenn man verschiedene Konzentrationen dieser Antibiotika betrachtet. Aminoglykosid-Adenylyltransferasen, die Streptomycin/Spectinomycin inaktivieren, weisen bevorzugte, aber keine ausschließliche Substratspezifität auf. Das bedeutet, dass eine gewisse Resistenz gegen eine niedrige Streptomycin-Konzentration durch die Aminoglykosid-Adenylyltransferase vermittelt werden kann, die in erster Linie auf Spectinomycin abzielt (oder umgekehrt). In der Praxis sind einige von ihnen jedoch so exklusiv, dass es gerechtfertigt ist, sie entweder als SmR oder als SpnR einzustufen. Wenn Sie es wissen möchten, können Sie es jederzeit ausprobieren… Eine weitere Erkenntnis dabei war, dass der Negativselektionsmarker ccdB in XL1 Blue NICHT funktioniert, während er in NEB5-alpha sehr wohl funktioniert. Anscheinend funktioniert ccdB auch nicht in DH5alpha und JM109 (was ist der Unterschied zwischen DH5alpha und NEB5alpha?).* pENTR-223.1 wird aufgrund der beiden SfiI-Schnittstellen, die das Insert flankieren, auch als pDONR-223.1 oder pENTR223.1-Sfi bezeichnet. Man neigt dazu, das Plasmid vor dem Einbau der cDNA als pDONR und nach dem Einbau der cDNA als pENTR zu bezeichnen. Diese Namensgebung ist jedoch nicht überall einheitlich. Nach dem Einbau des Inserts (mithilfe der Gateway-BP-Reaktion) verliert der Vektor pDONR223.1 die Selektionsmarker ccdB und chlR/CmR, und das resultierende Backbone wird meist als pENTR223.1 bezeichnet.