Wer führt heute noch Klonierungen mit Restriktionsenzymen durch?

Thu, 27 Jun 2024 00:00:00 +0000

Restriktionsenzyme spalten die DNA an bestimmten Stellen und ermöglichen so – zusammen mit DNA-Ligaseenzymen – die molekularen „Ausschneiden-und-Einfügen“-Vorgänge, die nach wie vor die Grundlage für die meisten heutigen rekombinanten DNA-Konstrukte bilden. Es gab zwar schon immer alternative Assemblierungsmethoden, doch vor etwa 10 Jahren bekam die Klonierung mit Restriktionsenzymen ernsthafte Konkurrenz durch die auf Homologie basierenden Ein-Röhrchen-Assemblierungsstrategien (vor allem durch das „Gibson-Assembly“-Verfahren und dessen Derivate). Dennoch nehmen Restriktionsenzyme nach wie vor einen wichtigen Platz in jedem Labor für rekombinante DNA ein.Es gibt nicht viele kommerzielle Anbieter mit einem großen Portfolio an Restriktionsenzymen. New England Biolabs und ThermoFisher sind die beiden großen Marktführer und die einzigen Anbieter mit mehr als 200 verschiedenen Enzymen. Alle anderen Anbieter (Roche, TaKaRa, Promega) haben ein weitaus weniger umfassendes Angebot. Vor etwa 10 Jahren habe ich argumentiert, dass niemand FastDigest-Enzyme von ThermoFisher verwenden sollte. Sie können diesen Blogbeitrag nachlesen, aber im Wesentlichen lautet die Kernaussage: „ThermoFisher stellt nicht genügend Informationen über seine Enzyme bereit, um sie in einer gemischten Umgebung mit Enzymen von Anbietern, die vollständige Transparenz bieten – wie beispielsweise New England Biolabs (NEB) – gleichberechtigt einsetzen zu können.“Diese Engstirnigkeit hat ThermoFisher dazu veranlasst, eine eigene Definition der Restriktionsenzymaktivität auf der Grundlage eines 5-Minuten-Fensters zu erfinden, was einen direkten Vergleich mit den Enzymen der Wettbewerber unmöglich macht, da diese das standardmäßige 1-Stunden-Fenster verwenden. Da Enzyme in einer Reaktion unterschiedlich lange aktiv bleiben und ThermoFisher – im Gegensatz zu NEB – keine Daten über die Aktivitätsdauer seiner Enzyme bereitstellt, ist kein aussagekräftiger Vergleich möglich. Man fragt sich, ob der einzige Zweck der neuen Einheitsdefinition darin bestand, jegliche Vergleiche zu verhindern. Das allein sollte schon Grund genug sein, ThermoFisher wie die Pest zu meiden, aber es gibt noch mehr. Im Jahr 2014 wies ich darauf hin, dass nach der Übernahme von Fermentas durch ThermoFisher kein einziges neues FastDigest-Enzym in die Produktpalette aufgenommen worden war. Diese Aussage trifft auch ein Jahrzehnt später noch zu (und gilt gleichermaßen für herkömmliche Restriktionsenzyme). Auch bei NEB hat sich die Innovation im Bereich der Restriktionsenzyme verlangsamt, doch seit 2015 hat NEB etwa fünf HighFidelity-Enzyme (ApoI, BbsI, BclI, BsiWI, BstZ17I) sowie einige konventionelle Restriktionsenzyme in sein Portfolio aufgenommen.Das größte Problem, das ich bei der Politik des Schweigens von ThermoFisher sehe, ist, dass kaum jemand weiß, dass das Unternehmen Isoschizomere unter dem Namen des Prototyp-Enzyms verkauft. Während ThermoFisher die Verwendung von Isoschizomeren in seinem Nicht-FastDigest-Sortiment offenlegt, gibt es die Identität seiner FastDigest-Enzyme nicht preis. Viele der FastDigest-Enzyme sind laut Arvydas Janulaitis , dem ehemaligen wissenschaftlichen Leiter von Fermentas , dem Unternehmen, das das FastDigest-System entwickelt hatte, bevor es 2010 von ThermoFisher übernommen wurde.In einem kürzlich aktualisierten Flyer versucht Thermo Scientific, sich gegenüber NEB als überlegen darzustellen, schafft es damit jedoch nur, Anfänger im Bereich der Klonierung zu täuschen. In ihrer Infografik versuchen sie, die Einfachheit der Pufferauswahl innerhalb des Restriktionsenzym-Portfolios von ThermoFisher hervorzuheben und es mit dem Portfolio von NEB zu vergleichen.Dabei ignorieren sie jedoch ihre 190 konventionellen Enzyme, die nicht mit dem FastDigest-Puffer kompatibel sind (und zu dieser Gruppe gehören wichtige Enzyme, z. B. das „GoldenGate“-Typ-IIS-Enzym BsmBI). Um das Bild zu korrigieren, habe ich einen besseren grafischen Vergleich zwischen ThermoFisher und NEB erstellt, der als Hauptbild dieses Blogbeitrags dient. Selbst mein Vergleich ist optisch irreführend, da er redundante Enzyme nicht berücksichtigt, von denen ThermoFisher aufgrund seiner aggressiven Akquisitionsstrategie viele im Sortiment hat. In diesem Vergleich sieht es so aus, als ob ThermoFisher mehr verschiedene Enzyme anbietet, doch das ist keineswegs der Fall. Berücksichtigt man die Redundanzen, so verfügt NEB über 257 verschiedene, im Handel erhältliche Restriktionsenzyme, während ThermoFisher nur 209 anbietet. Ich habe nicht selbst gezählt, sondern mich auf die neueste Enzym-Beschreibungsdatei der besten Software zur Klonierungsplanung und -dokumentation SnapGene gestützt. Im Jahr 2014 habe ich bemängelt, dass ihr „Fast Digest“-Puffer eine proprietäre Zusammensetzung hat, und als ich heute nachgesehen habe, war das immer noch der Fall. Auf dem Gebiet der Restriktionsenzyme hat es bei Thermo Fisher keinerlei Fortschritte gegeben: keine Innovationen, keine größere Transparenz.

FastDigest on Michael’s Domain

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