FPLC on Michael’s Domain

Bio-Rad repariert unser NGC

Wed, 20 Sep 2023 00:00:00 +0000

UPDATE (Stand: 21. Dezember 2024)

Wir haben gerade unseren Kurs zur Proteinreinigung (DPDR-305) hinter uns gebracht (siehe auch meine anderen blog posts über Lehre ). Nachdem wir etwa 25 Aufreinigungen mit dem „reparierten“ Bio-Rad NGC durchgeführt haben, muss ich leider feststellen, dass das größte Problem weiterhin besteht: Das FPLC reagiert nicht mehr auf manuell eingegebene Befehle. Auch die zufälligen Verbindungsabbrüche hielten an. Zwar hatte nur eine Studentengruppe Probleme, doch kam es an diesem einen Tag zu mehreren Vorfällen. Damit endet leider unser kurzer Ausflug in das Bio-Rad-Territorium der Proteinreinigung. All dies deutet darauf hin, dass weitere Investitionen in dieses Gerät reine Zeit- und Geldverschwendung wären. Wir haben weder zu viel Zeit noch zu viel Geld. Wenn Bio-Rad aus eigener Initiative etwas unternehmen möchte, bin ich gerne bereit, ihnen alle notwendigen Maßnahmen zu überlassen, um das Gerät in einen nutzbaren Zustand zu versetzen, aber wir werden keine weiteren Schritte aktiv verfolgen. Der beste Weg, Ihr FPLC-Gerät in gutem Zustand zu halten, ist ein Wartungsvertrag. Obwohl wir in den letzten 30 Jahren zweimal Mittel von unserer Universität erhalten haben, um ein FPLC-Gerät der Spitzenklasse anzuschaffen, ist es viel schwieriger, Mittel für einen Wartungsvertrag zu bekommen. Einer der vielen Gründe dafür ist, dass die meisten Förderzeiträume kürzer sind als Wartungsverträge, die nur dann Sinn machen, wenn sie über mehrere Jahre abgeschlossen werden.

Showdown: „Äkta“ von GE Healthcare gegen „NGC“ von Bio-Rad

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Seit 1996 beschäftige ich mich mit der Reinigung von Proteinen. Bis 2015 arbeitete ich mit einem Äkta Explorer, dann haben wir auf den Äkta Avant umgestellt. Im Jahr 2020 zog mein Labor um, und wir erhielten einen Bio-Rad NGC , den wir nun seit zwei Jahren nutzen.Wir hatten viele Probleme mit dem Bio-Rad NGC. Zunächst dachte ich, dass dies beim Systemwechsel vielleicht normal sei. Ich ging davon aus, dass die Probleme nach und nach verschwinden würden. Schließlich hatten wir auch Probleme, als wir vom Explorer auf den Avant umgestiegen sind.Doch selbst nach zwei Jahren und Dutzenden von Aufreinigungsläufen scheinen die Probleme mit dem NGC nicht aufzuhören. Immer wenn wir ein Problem lösen, taucht ein neues, bisher unbekanntes Problem auf. Und im Gegensatz zu GE Healthcare ist der Kundenservice von Bio-Rad nicht einmal annähernd so gut wie der, den wir von GE Healthcare gewohnt sind. Als unsere IT-Abteilung den Äkta nicht mit dem Netzwerk unserer Universität verbinden konnte, schickte GE Healthcare einen Techniker aus ihrem Münchner Team nach Helsinki, um das Problem zu beheben. In Anbetracht der Einarbeitungszeit bot GE Healthcare außerdem einem Mitarbeiter aus unserem Team die kostenlose Teilnahme an einem ihrer Kurse an. Und ihr Support beschränkte sich nicht auf die Garantiezeit! Sie wollten wirklich, dass wir mit ihrem Gerät zufrieden sind. Von Bio-Rad erfahren wir nicht das gleiche Maß an Unterstützung. Es fühlt sich immer so an, als müssten wir sie dazu zwingen, die Probleme zu lösen, die wir mit dem NGC haben, und ihre Reaktionszeit liegt weit unter jeglichen Kundenerwartungen.Dies ist der erste von mehreren Blogbeiträgen zum Thema „Äkta versus NGC“. Ich hoffe, dass ich in den nächsten Monaten die Zeit finden werde, ausführlicher über all unsere Probleme zu berichten.Wir haben 2015 beschlossen, dass wir endlich ein neues FPLC brauchten. Unser Äkta Explorer näherte sich dem Ende seiner Lebensdauer, und wir hatten rund 100.000 Fördermittel erhalten, um das FPLC unserer Zentraleinrichtung zu erneuern. Das Gerät war so teuer, dass wir das offizielle Ausschreibungsverfahren durchlaufen mussten (damals lag die Obergrenze bei 30.000 €, inzwischen wurde sie jedoch auf 60.000 € angehoben). Es gab nur zwei Mitbewerber: den Bio-Rad Discover NGC und den GE Healthcare Äkta Avant. Das Bio-Rad-Gerät war günstiger (82.810 € gegenüber 95.470 €), doch wir entschieden uns für den Kauf des Geräts von GE Healthcare. Ein wichtiger Grund dafür war, dass alle unsere Nutzer bisher den Äkta Explorer und dessen Unicorn-Software verwendet hatten. Ein Wechsel wäre einfach zu störend gewesen und hätte viel Unterstützung und Zeit unsererseits erfordert. Es gab jedoch auch technische Gründe, die uns dazu veranlassten, den Äkta dem NGC vorzuziehen: Vorteile des Äkta Avant

Aktualisierung des GE Äkta Avant auf Windows 10

Tue, 18 Feb 2020 00:00:00 +0000

Das Avant ist das Flaggschiff der Äkta-Produktreihe von GE Healthcare im Bereich der FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie). Wir nutzen es regelmäßig, und es steht allen an der Universität Helsinki zur Verfügung.Unsere Universität hat beschlossen, sich mit Microsoft gut zu stellen und jeglichen Netzwerkverkehr für Windows-7-Computer zu unterbinden. Da unser Äkta (2015 angeschafft) von vielen verschiedenen Forschern genutzt wird, verlassen wir uns auf Microsofts Active Directory, um Benutzer zu authentifizieren und die Gerätenutzung zu verfolgen. Als die Universität Ende Januar den Windows-7-Verkehr tatsächlich sperrte, haben wir den HP-Computer schließlich von Windows 7 auf Windows 10 aktualisiert. Zuvor hatten wir uns mit GE in Verbindung gesetzt, um sicherzustellen, dass das FPLC weiterhin funktioniert. Obwohl die Build-Nummer von Windows 10, die unsere Universität verwendet (Windows 10 Enterprise Version 1809, Build 17763.1039) von keiner der Unicorn-7-Versionen unterstützt wurde, die GE im Laufe der Jahre veröffentlicht hat (siehe diese Software-Kompatibilitätsübersicht, die ich auf der GE-Website nicht mehr finden kann: https://drive.google.com/open?id=1cA33lEqfEr0MIaA8r9TyoQFcxiHWuZsp) , wurde uns versichert, dass die Software weiterhin funktionieren würde. Leider traf dies nicht zu.**In-Place-Upgrade oder Neuinstallation?**Wir haben ein In-Place-Upgrade von Win7 auf Win10 durchgeführt. Das hat mir noch nie gefallen. Selbst bei etwas überlegenen Betriebssystemen wie macOS und Linux verliefen die Upgrades vor Ort nicht immer reibungslos. Ein Neuanfang war immer die sicherere (und auch schnellere) Wahl.VerbindungsproblemeNach dem Upgrade verlor Unicorn 7 während laufender Proteinreinigungsläufe zunehmend die Verbindung zum Äkta Avant. Bei manuellen Läufen konnten wir deutlich erkennen, dass bestimmte Befehle einen Verbindungsabbruch auslösten. Das Äkta-LCD-Display wurde schwarz und das Gerät startete neu. Natürlich vermuteten wir, dass dies eine Folge des Upgrades auf Windows 10 war. Da Unicorn 7.0.2 nicht auf die Kompatibilität mit unserer Windows-10-Version getestet worden war, wollten wir zunächst versuchen, auf eine Unicorn-7-Version zu aktualisieren, die mit unserem Windows-10-Build getestet worden war. Ich hatte bereits im Dezember bei GE um dieses Update gebeten, aber meine Anfrage war ignoriert worden, und da ich zu dieser Zeit viele andere Dinge zu tun hatte, habe ich mich nie wieder mit diesem Problem befasst (im Nachhinein ein großer Fehler).Software-UpdatesWas Chrome und Firefox wöchentlich still im Hintergrund erledigen (ohne dass der Nutzer es bemerkt), erfordert im Fall von GE fast zwei Wochen Vollzeitaufwand seitens des Nutzers. Ein einfacher Download mag bei Bio-Rad funktionieren, doch GE verlangt ein kompliziertes, undurchsichtiges, nicht transparentes, benutzerunfreundliches, sich ständig änderndes und nicht DSGVO-konformes System, das zudem auf Servern gehostet wird, die so langsam sind, dass man sich ständig fragt, ob der Browser-Tab eingefroren ist. Was es auch wert sein mag: Die Webseiten von GE waren trotz mehrerer Neugestaltungen und der digitalen Transformation von GE schon immer so. Der E-Mail-Verlauf zwischen mir und verschiedenen GE-Supportadressen umfasst bis heute 60 E-Mails (beginnend mit meiner ersten Supportanfrage am 2. Dezember 2019). Hinzu kommen noch einige Telefonate (da E-Mails offenbar oft standardmäßig als „nicht dringend“ eingestuft werden).Datenschutzbedenken hinsichtlich des Umgangs von GE mit KundendatenNachdem ich eine Bestellung für den Download aufgegeben, ein Angebot erhalten, die Bestellung bestätigt und eine Bestellbestätigung erhalten hatte, erhielt ich schließlich die „Erlaubnis“, die neueste Version von Unicorn (nämlich 7.5) herunterzuladen. Ich loggte mich in das „eDeliveryPortal“ von GE ein und stellte fest, dass ich die Softwareberechtigungen und Downloads vieler anderer GE-Kunden sehen konnte, aber keine meiner eigenen. Nach einigem Hin und Her tauchte die Version 7.5 schließlich unter meinen Downloads auf. Meine Lizenz fehlt bis heute. Aber warum sollte ich mir die Mühe machen? Ich könnte jede der anderen Lizenzen nutzen (nachdem ich die MAC-Adresse meines Computers gefälscht habe, da die Software offenbar über die MAC-Adresse der Netzwerkkarte des Computers an einen bestimmten Computer gebunden ist). Dies ist eindeutig ein Verstoß gegen die DSGVO , da es absolut keinen Grund gibt, warum meine Daten (Berechtigungs-IDs, MAC-Adressen, Namen, E-Mail-Adressen) anderen Kunden zugänglich sein sollten. Möglicherweise betrachtet GE die Universität Helsinki als einen einzigen Kunden; das wäre ein vorsätzlicher Verstoß gegen die DSGVO.**Suche nach den Systemkonfigurationsdateien (d. h. der Firmware)**Wir hatten die Systemkonfigurationsdateien jedoch nicht aktualisiert, da ich sie auf der GE LifeScience-Website nicht finden konnte. Wir verwendeten Version 3, während Version 3.6 die aktuellste war. Bemerkenswert ist, dass diese Dateien auch die Firmware für die einzelnen Äkta-Komponenten enthalten. Es scheint, als sei dieser Download gut versteckt. Ich benötigte Hilfe von GE, um ihn zu finden. Die GE LifeScience-Website verfügt über eine Suchfunktion, und die Suche findet den Download sogar. Allerdings ist er möglicherweise der letzte Eintrag in einer Liste von fast 1.000 Treffern (10 Treffer pro Seite). Ein Tipp an GE: Google versteht etwas von Suche! Wenn ihr einfach Google eure gesamte Website indexieren lassen würdet, würden Kunden alles über eine Google-Suche finden. Viele Unternehmen nutzen Google für die interne Suche auf ihrer Website. GE scheint jedoch nur seine Produktseiten für Suchmaschinen-Crawler zugänglich zu machen, nicht aber seine Support-Seiten.**Wo sind unsere Lizenzdateien?**Nach der Aktualisierung der Gerätekonfiguration bestand das Problem weiterhin. Nachdem wir einen Systembericht (und anschließend einen zweiten „erweiterten“ Systembericht) gesendet hatten, kam GE zu dem Schluss, dass höchstwahrscheinlich unser In-Place-Upgrade von Win7 auf Win10 schuld sei, da sie einige Unregelmäßigkeiten in der Datei „SystemEventLog.xml“ feststellen konnten. Ich hatte keinen Grund, an dieser Erklärung zu zweifeln, und bat daher unsere IT-Mitarbeiter um eine Neuinstallation von Windows 10. Anschließend installierte ich Unicorn 7.5, musste jedoch feststellen, dass das Problem weiterhin bestand. Nur als Randbemerkung: Wir hatten ein selbstverschuldetes Problem mit unserer Lizenzdatei (.lic). Das Unicorn-Installationsprogramm verlangt die Installation einer Lizenzdatei, die ich im eDelivery-Portal nirgendwo zum Download gefunden habe (wir haben diese Lizenzdateien als E-Mail-Anhänge direkt vom GE-Support erhalten – warum stehen sie nicht zum Download bereit, da sie leicht verloren gehen können?). Wir hätten eine Kopie unserer Lizenzdatei anlegen sollen, bevor wir unseren Computer für die Neuinstallation von Windows 10 gelöscht haben, aber das haben wir versäumt, und ich musste die Lizenzdatei aus einem Systemsicherungs-Backup herausfischen, das ich glücklicherweise 2016 von diesem Rechner erstellt hatte. Und ich suche immer noch nach unseren Lizenzdateien für verschiedene Systemkomponenten (Classic Evaluation und Column Handling), die zum Zeitpunkt der Systemsicherung noch nicht installiert waren.Downgrade auf Windows 7Um sicherzugehen, dass es sich nicht um einen Hardwarefehler handelte, beschlossen wir, das System wieder auf Windows 7 und Unicorn 7.0.2 zurückzusetzen. Das war schwieriger als erwartet, da wir Windows 7 auf Universitätsrechnern nicht mehr installieren können. Glücklicherweise hatten wir noch einen alten, ungenutzten Dell-Desktop, auf dem Windows 7 lief. Unicorn 7 benötigt zwei Netzwerkkarten (eine für die Kommunikation mit der Außenwelt und eine für ein separates 10. Netzwerk zur Kommunikation mit dem Äkta Avant). Wir haben die Netzwerkkarte von unserem Standardrechner in diesen alten Win-7-Rechner eingebaut. Die Installation und der Betrieb von Unicorn erfordern jedoch einen Internetzugang, da die Software „nach Hause telefoniert“. Genau das ist für Windows-7-Rechner an unserer Universität nicht erlaubt. Daher musste ich über mein Smartphone ein privates Netzwerk einrichten, damit Unicorn 7 mit der GE-Zentrale kommunizieren konnte. Schlimmer noch: Ich musste die MAC-Adresse unseres Standardcomputers klonen, da unsere Unicorn-7-Software offenbar über die MAC-Adresse des Computers an einen bestimmten Rechner gebunden ist. Und ein WLAN-Zugang kam nicht in Frage, da die ursprüngliche MAC-Adresse von einer kabelgebundenen Netzwerkkarte stammte. Es ist nicht möglich, MAC-Adressen zwischen kabelgebundenen Netzwerkkarten und USB-WLAN-Adaptern zu klonen, da MAC-Adressen von WLAN-Karten ein festes Präfix haben. Daher musste ich eine komplizierte Konfiguration von meinem Smartphone über einen Computer zu einem (Kabel-)Router und schließlich zum Dell-Computer mit Windows 7 vornehmen.Windows 10 ist nicht schuld – F-Secure ist der ÜbeltäterZu meiner Überraschung stürzte der Äkta Avant immer wieder ab, wenn Unicorn 7 unter Windows 7 Befehle wie „pause“ oder „end“ ausgab. Doch dann wurde mir klar, dass der Avant – anders als unser alter Äkta Explorer – für die Gerätekommunikation normale Netzwerkkarten verwendet und die Win10-Version der Universität Helsinki standardmäßig durch Fernsteuerungs- und Sicherheitssoftware „erweitert“ ist. Ich ging zur Systemsteuerung und deinstallierte alle Software-Erweiterungen, die von der Universität installiert worden waren. Insbesondere F-Secure Client Security Premium gehörte zu den Programmen, die ich deinstalliert habe. Nach einem Neustart konnte ich den Äkta Avant nicht mehr zum Absturz bringen. Um diesen Befund zu bestätigen, steckte ich die Netzwerkkarte wieder in unseren ursprünglichen Standardcomputer, startete den Rechner neu und blieb beim BitLocker -Bildschirm von Windows hängen. Eine Änderung der Hardwarekonfiguration führt unweigerlich dazu, dass Windows den Startvorgang verweigert. Das hat mich zwar etwas aufgehalten, da ich die IT-Abteilung unserer Universität hinzuziehen musste, die chronisch überlastet und schwer zu erreichen ist. Ich habe die Firewall von F-Secure Client Security Premium gezielt deaktiviert, woraufhin die Abstürze auch unter Windows 10 sofort aufhörten. Es ist sehr schwer zu begründen, warum unsere Universität Produkte von F-Secure benötigen sollte. Windows selbst verfügt (seit XP SP2) über eine sehr leistungsfähige Firewall und hat zudem eine eigene Antivirensoftware ( Windows Security Essentials / Windows Defender ), die mindestens genauso gut ist wie ihre besten Konkurrenten – ganz abgesehen davon, dass sie kostenlos und vollständig in Windows integriert ist (und es nicht erforderlich macht, Hooks von Drittanbietern tief in das Betriebssystem einzubinden).Windows 10 läuft auf unserer Hardware aus dem Jahr 2015 zu langsamEs bleibt uns nur noch, unseren Standardcomputer auf neuere Hardware aufzurüsten. Unsere Fakultät hatte ältere Win7-Computer im Jahr 2019 durch neue Geräte ersetzt, doch dieser Computer war einen Tag zu neu, um in die Aufrüstung einbezogen zu werden. Er ist jedoch bereits fünf Jahre alt und läuft insbesondere nach dem Windows-10-Upgrade sehr langsam. Wenn Ihr Protein während der Aufreinigung eluiert, möchten Sie nicht, dass die Fraktionssammlung erst nach einigen Sekunden beginnt, sondern dass sie sofort startet.

Kurs zur Proteinreinigung 2019

Wed, 31 Jul 2019 00:00:00 +0000

Auch in diesem Dezember veranstalten wir wieder den DPBM-Kurs zur Proteinreinigung in unserem Labor. Sichern Sie sich Ihren Platz, denn dieser praxisorientierte Kurs ist sehr beliebt und es gibt nur 16 Plätze. Sie können Ihr eigenes Protein mitbringen, und wir passen das Kursprogramm individuell an Ihre Bedürfnisse an!Weitere Informationen: http://research.med.helsinki.fi/corefacilities/b3p/teaching.htmlRegistration : https://courses.helsinki.fi/en/dpbm-135/131042336

Praktikum: Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine (DPBM-135)

Sun, 10 Dec 2017 00:00:00 +0000

Unterrichtsmaterialien, Ergebnisse usw. für den DPBM-Kurs „Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine“ ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ):

Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Wir organisieren (erneut) einen praxisorientierten Kurs zur Proteinreinigung vom 4. bis zum 20. Dezember. Wir können maximal 16 Teilnehmer aufnehmen, die in Gruppen von 2 bis 4 Teilnehmern eingeteilt werden. Jede Gruppe benötigt drei volle Tage, um die praktischen Übungen durchzuführen, wobei sich der dritte Tag des Kurses mit dem ersten Tag der nächsten Gruppe überschneidet. Veranstaltungsort ist das Biomedicum Helsinki, Räume A516a1 (wo sich die Geräte befinden) und B318a/b (unser Labor). Wir werden ein Protein (VEGF-Rezeptor 3) mithilfe eines zweistufigen Protokolls (Affinitätschromatographie + Gelfiltration) auf dem Äkta Avant FPLC-Gerät aufreinigen. Am dritten Kurstag werden wir die Wechselwirkung dieses Proteins mit seinem Liganden (VEGF-C) auf dem ITC-Gerät (isotherme Kalorimetrie) untersuchen. Wir haben bereits 2015 einen ähnlichen Kurs angeboten ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Dieser neue Kurs ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) wird einen ähnlichen Aufbau haben, wir erweitern ihn jedoch um einen Tag, um Protein-Wechselwirkungen mithilfe des neuen Isothermischen-Kalorimetrie-Geräts unserer B3P-Kernanlage zu analysieren. Die Dokumentation und die Ergebnisse werden ebenfalls hier verfügbar sein.Da wir maximal zwei Proben gleichzeitig bearbeiten können (wir verfügen „nur“ über zwei FPLC-Geräte), müssen wir die Teilnehmer in Gruppen (mit jeweils 2–4 Studierenden) aufteilen und den dreitägigen Kurs je nach Teilnehmerzahl mehrmals wiederholen.

Testbericht zum Äkta Avant 25 von GE Healthcare

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Vor etwa einem Jahr haben wir im Rahmen einer internen Ausschreibung der Fakultät Fördermittel erhalten, um das alte Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC-Gerät der Zentrale Einrichtung für Proteinproduktion und -reinigung zu ersetzen. Der Äkta Explorer war 1996(?) angeschafft worden, als die schwedische Marke Pharmacia noch existierte. Im Jahr 2014 trat das Worst-Case-Szenario ein: Sowohl der Monochromator als auch Xenon-Blitzlampe fast gleichzeitig ausfielen, was uns eine Rechnung von fast 10.000 € bescherte. Daher wollten wir das Gerät durch ein modernes Modell ersetzen. Es gibt nur zwei Unternehmen, die in diesem Bereich seriöse Geräte anbieten, nämlich GE Healthcare ( Äkta-Produktreihe ) und BioRad ( NGC-Produktreihe ). GE Healthcare hat die Marke Äkta im Zuge mehrerer Fusionen von Pharmacia übernommen, während BioRad mit seinen NGC-Modellen, die erst vor wenigen Jahren auf den Markt kamen, ein relativ neuer Wettbewerber ist.Wir haben uns für das Äkta Avant 25 entschieden. Wir wollten auf jeden Fall einen gekapselten, gekühlten Fraktionssammler haben. Außerdem war uns eine vertraute Benutzererfahrung wichtig. Wir führen häufig automatisierte Aufreinigungen durch und möchten nicht, dass unsere Proteine längere Zeit bei Raumtemperatur in offenen Röhrchen stehen, in die Bakterien und Staub aus der Luft eindringen können. Mittlerweile setzen wir den Äkta Avant seit etwa einem halben Jahr ein und haben inzwischen einen guten Eindruck davon, wie er im Vergleich zum Äkta Explorer abschneidet. Obwohl der Avant moderner ist als der Explorer, nutzen alle Anwender unserer Zentraleinrichtung nach wie vor den Explorer. Sie sind mit der Benutzeroberfläche von Unicorn 5.11 vertraut und haben offenbar kein Interesse daran, sich in die – zugegebenermaßen – kompliziertere Benutzeroberfläche des Avant einzuarbeiten. Ein weiterer Grund dafür, dass das Gerät bisher nur intern genutzt wurde, war jedoch die beträchtliche Anzahl an Problemen, auf die wir gestoßen sind. Bei unserem alten Äkta Explorer haben wir noch nie so viele Probleme in so kurzer Folge erlebt. Ich weiß nicht, ob unsere Situation typisch ist (laut den Vertretern von GE Healthcare ist dies nicht der Fall). Dennoch sind hier die Probleme aufgeführt, auf die wir gestoßen sind:

FPLC-Kurs zur Proteinreinigung

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Acht Doktoranden hatten sich für den FPLC-Kurs zur Proteinreinigung angemeldet, der im Dezember stattfand. Wenn ich etwas gelernt habe, dann, dass die Proteinreinigung im Rahmen eines Kurses IMMER mit einem Protein und einem Protokoll durchgeführt werden sollte, die bereits VIELE Male erfolgreich angewendet wurden. Von den Studierenden mitgebrachte Proteine sind eine hervorragende Lernquelle, doch die zeitlichen Einschränkungen eines Kursformats erlaubten es uns nicht, die Aufreinigung dieser Proteine noch während des Kurses abzuschließen.Technische Probleme mit dem neuen Äkta Avant 25Zudem war das Äkta Avant 25 , die wir diesen Sommer neu bei GE Healthcare erworben hatten, fiel während des Kurses ZWEIMAL aus. Zunächst fiel der Steuerungscomputer aus (RAID-Ausfall). HP lieferte die Ersatzfestplatte innerhalb von 24 Stunden, und nachdem sich das RAID wiederhergestellt hatte, konnten wir den Kurs fortsetzen. Beim ersten Durchlauf nach diesem Vorfall trat beim Äkta jedoch ein Überdruckproblem auf. Wir identifizierten einen defekten Durchflussbegrenzer als Ursache identifiziert, wollten den Lauf jedoch nicht fortsetzen, da wir bei früheren Durchläufen bereits schwerwiegende Probleme mit Luftblasen hatten. Daher führten wir die Durchläufe auf dem alten Äkta Explorer 100 durch. GE Healthcare ließ das System umgehend von einem Servicetechniker überprüfen, doch da dieser kein Ersatzgerät dabei hatte, mussten wir bis Montag, den 14.12., warten, bis der Äkta Avant wieder voll funktionsfähig war.Was wir aufgereinigt haben: lösliches VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) und HepsinWir haben lösliches humanes VEGF-Rezeptor-3 aufgereinigt (die ersten drei Domänen seiner extrazellulären Domäne, verbunden mit dem konstanten Fc-Teil von humanem IgG). Diese Aufreinigung haben wir bereits mehrfach durchgeführt. Sie entspricht der Aufreinigung von Antikörpern mit Protein-A-Sepharose.Wir hatten im Vorfeld konditioniertes Zellkulturmedium vorbereitet. Wir produzieren die meisten unserer Proteine in Insektenzellen (hauptsächlich Drosophila S2), und das VEGFR-3/Fc war von den S2-Zellen nach Induktion des Metallothionein-Promotors mit 1 mM Cu²⁺ über etwa 4,5 Tage hinweg in das Medium sekretiert worden. Die Vorbereitung des Mediums für die Aufreinigung besteht lediglich aus 1) dem Entfernen der Zellen durch Zentrifugation und 2) der Filtration, um Präzipitate und andere kleine Partikel zu entfernen, die die Säule verstopfen könnten. Eine Anpassung des pH-Werts ist nicht erforderlich.Eine schnelle Neutralisierung nach der Elution bei niedrigem pH-Wert IST WICHTIGWir haben das Medium über eine Einweg-5-ml- HiTrap-Rekombinant-Protein-A-Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von etwa 1 ml/min und eluierten es mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Die eluierten 2-ml-Fraktionen wurden sofort mit 400 µl 1 M Tris (pH 8,5) neutralisiert. Hier unterlief uns bei einer der beiden Aufreinigungen ein kleiner Fehler. GE Healthcare hatte die Kassetten für die 5-ml-Sammelröhrchen noch nicht freigegeben (dies ist bis heute nicht geschehen, obwohl sie bereits für September 2015 versprochen worden waren), und wir verwendeten 15-ml-Falcon-Röhrchen zur Sammlung der 2-ml-Fraktionen, in die wir zuvor 400 µl der Neutralisationslösung alikvotiert hatten. Allerdings war die Durchmischung in diesen Röhrchen nicht effizient, und die längere Einwirkung eines niedrigen pH-Werts führte zu einer teilweisen Schädigung unseres Proteins. Dies lässt sich beim Vergleich der Größenausschluss-Chromatogramme von Gruppe 2 mit denen von Gruppe 4 erkennen: Bei Gruppe 4 ist der erste Peak (aggregiertes Protein) im Vergleich zum entsprechenden Peak bei Gruppe 2 deutlich größer und heterogener. Tatsächlich fällt VEGFR-3/Fc, wenn es bei niedrigem pH-Wert aus Protein-A-Säulen eluiert wird, bei höheren Konzentrationen kurz nach der Elution stets aus, löst sich jedoch bei Neutralisation wieder auf. Dies geschah in den Fraktionen 5.A.3 und 5.A.4 (Gruppe 4) nicht, da sich Eluat und Neutralisationspuffer im 15-ml-Falcon-Röhrchen nicht ausreichend vermischten (wahrscheinlich trug auch die Fraktionsgröße von 2 ml dazu bei; 1 ml wäre besser gewesen). Während des Laufs für Gruppe 2 haben wir die Röhrchen unmittelbar nach Beendigung des Laufs entnommen und dadurch die Puffer vermischt, während der Lauf für Gruppe 4 über Nacht endete und das Eluat bis zum Morgen weitgehend unvermischt blieb.Alternativ hätten wir mit einem hochkonzentrierten chaotropen Salz bei nahezu neutralem pH-Wert eluieren können (was wir beim nächsten Mal tun werden, falls wir einen automatisierten Lauf haben, bei dem die Elution mitten in der Nacht stattfindet). Pierce bietet einen (proprietären) „sanften“ Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 6,6 an. Ich kenne die Zusammensetzung des Pierce-Puffers nicht, aber es handelt sich um eine hochkonzentrierte Lösung eines chaotropen Salzes. 3 M Kalium-/Natriumthiocyanat oder 4 M Magnesiumchlorid in gepufferten Lösungen um pH 7 sind häufig verwendete chaotrope Salze für diesen Zweck. Hepsin Die von den Studierenden bereitgestellten Proteine stellten eine Herausforderung dar. Erstens war ihre Konzentration im Ausgangsmaterial sehr gering. Während wir das Protein deutlich erkennen können, wenn das VEGFR-3/Fc-konditionierte Medium auf einem PAGE-Gel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt wird, ist für das Hepsin kein solches Band sichtbar. Zudem schien ein erheblicher Anteil des Proteins das Histag (nicht mehr) zu enthalten und wird daher im ersten Reinigungsschritt nicht aufgefangen. Der Anteil an Hepsin-H6, der an Ni²⁺-Sepharose bindet, eluiert bereits bei einer Imidazol-Konzentration von 20 mM, was das Waschen der Säule erschwert. Das Hepsin mit dem längeren Histag (H10) übersteht die 20 mM Imidazol-Waschung zwar, weist jedoch ebenfalls niedrige Expressionsniveaus auf. Nachfolgend sind die Chromatogramme der einzelnen Durchläufe sowie die kommentierten Bilder der mit Coomassie gefärbten PAGE-Gele dargestellt. Das detaillierte Protokoll für den Betrieb des Äkta Avant 25 befindet sich noch in Vorbereitung…