Rekonstruktion der Sequenz eines Entry-Vektors (pENTR221) aus der OCAA-Bibliothek

Fri, 30 Oct 2020 00:00:00 +0000

Dieser Artikel richtet sich an Personen, die sich mit molekularer Klonierung beschäftigen. Genauer gesagt an diejenigen, die mit Gateway-Vektoren arbeiten. Nehmen wir an, Sie haben von jemandem einen Gateway-Klon erhalten. Sie kennen die Insertsequenz und Sie kennen das Backbone. Eines der gängigsten Backbones ist pENTR221. Nehmen wir als Beispiel das Insert der humanen CTSL1-cDNA, genauer gesagt den Klon mit der ID 100010639 aus der OCAA-Klon-Sammlung. Die Insert-Sequenz kennen Sie anhand der Zugangsnummer (BC012612).Sie benötigen die vollständige DNA-Sequenz dieses Vektors, um eine intelligente Klonierungssoftware wie SnapGene zur Unterstützung Ihres Klonierungsdesigns nutzen zu können. Diese Software setzt jedoch voraus, dass Sie über die vollständige Sequenz des Konstrukts (oder zumindest über die vollständigen Sequenzen seiner wichtigen Teile) verfügen. Wie finden Sie also die vollständige Sequenz des pENTR221-CTSL1-Klons heraus? Die Insertsequenz können Sie bei NCBI abrufen: Geben Sie einfach die Zugangsnummer ein, die Sie für Ihren Klon erhalten haben. Lade die Sequenz im Fasta- oder Genbank-Format herunter. Interessanterweise kennt die ansonsten so leistungsfähige SnapGene-Software den pENTR221-Vektor nicht. Du musst also nach dem Vektor-Backbone „pENTR221 DNA-Sequenz“ googeln. Sie erhalten viele Treffer; hier sind nur vier davon: 1. http://dnasu.org/DNASU/GetVectorDetail.do?vectorid=2792 . https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=279 3. https://www.genomics-online.com/vector-backbone/48/pentr221/4 . http://yrgene.com/documents/vector/pentr221.pdfMatthias : Der Autor der vierten Quelle stellt die Sequenz in einer PDF-Datei zur Verfügung, was nicht empfehlenswert ist. Wenn Sie die DNA-Sequenz aus dieser Datei kopieren, wird sie völlig durcheinandergebracht, da PDF die Gruppierungen von jeweils 10 Nukleotiden nicht zeilenweise ausliest. Lieber Matthias, verwenden Sie kein PDF zur Verbreitung oder Dokumentation von DNA-Sequenzen! Wenn du es dennoch tun MUSST, füge dem PDF bitte eine reine Textdatei mit der Nukleotidsequenz als Anhang hinzu! Natürlich kannst du die DNA-Sequenz mit einem leistungsfähigen PDF-Tool wie PDF Studio Pro in der richtigen Reihenfolge extrahieren. Aus irgendeinem seltsamen Grund weicht die Sequenz der dritten URL von den anderen vier ab, da sie als einzige die vollständigen Verbindungsstellen (attL1 und attL2) enthält. Es spielt jedoch keine Rolle, welche der Sequenzen du für den Assembly verwendest, da die Unterschiede alle in dem Bereich liegen, der während des Assembly-Prozesses entfernt wird (ich weiß nicht, wie der pENTR221-Vektor für das Bibliotheksklonieren in meinem konkreten Beispiel vorbereitet wurde, aber es sieht für mich so aus, als wäre der ursprüngliche Vektor mit einem einzigen DraI-Schnitt (der stumpfe Enden erzeugt) geöffnet worden und dann wären zuerst die Linker und danach das Insert hinzugefügt worden. Ich schlage vor, dass du die Sequenz aus der dritten URL verwendest (da sie im Fasta-Format vorliegt), sie in SnapGene importierst und SnapGene gemeinsame Merkmale erkennen lässt. Nun brauchst du noch den Linker. Woher weißt du, welcher Linker verwendet wurde? Wir beziehen die meisten unserer Gateway-Klone aus einer hauseigenen Nachbildung der OCAA-Klonsammlung, und du kannst die vollständige Liste der Klone als Excel-Tabelle hier herunterladen. Die Daten enthalten für jeden Klon die verwendeten Linker (es gibt 8 verschiedene 5’-Linker und 16 verschiedene 3’-Linker). Leider scheint diese Excel-Tabelle einige Fehler zu enthalten, da manche Linker ein Stoppcodon enthalten, aber dennoch als „ohne Stopp“ gekennzeichnet sind und umgekehrt. Für unseren Beispielklon wurden folgende Linker verwendet: 5’-Linker: GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG 3’-Linker:TAGGACCCAGCTTTCTTGTAC Fast alle 5’-Linker enthalten die Kozak-Sequenz (CACC) als letzte Nukleotide vor Beginn des Inserts, und einige enthalten zusätzlich zur Kozak-Sequenz auch das ATG selbst (wie der oben genannte). Am anderen Ende des Linkers lässt sich die homologe Sequenz leicht anhand des Endes von attL1 des pENTR221-Backbones (GTACAAAAAAG) identifizieren. Die 3’-Linker sind heterogener, enthalten jedoch alle die Sequenz CTTTCTTG aus attL2. Werden sie zur Herstellung von Klonen mit einem Stoppcodon verwendet, beginnen sie alle mit genau diesem Stoppcodon (TAG, TGA oder TAA). Nun müssen Sie nur noch den offenen Leserahmen aus Ihrer Insertsequenz zwischen die Linkersequenzen kopieren. Falls Ihr 3’-Linker das Start-ATG enthält, müssen Sie dieses überspringen. Kopieren Sie auch nicht das Stoppcodon, da es bei den „Klonen mit Stoppcodon“ immer im Linker enthalten ist und bei den „Klonen ohne Stoppcodon“ nicht vorhanden sein soll. In unserem Beispiel umfasst diese Sequenz die Nukleotide 202–1197 der Zugangsnummer BC012612 . Das wäre:AATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGNun fügen wir den Linker hinzu (erste und letzte Zeile):GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTAGGACCCAGCTTTCTTGTACNun haben wir das erste Problem: Es befindet sich ein Stoppcodon im 3’-Linker (direkt am Anfang der letzten Zeile), obwohl der Klon laut den uns vorliegenden Informationen „ohne Stoppcodon“ sein sollte.Wir haben den Klon sequenziert und festgestellt, dass der einzige Unterschied zwischen den Klonen mit und ohne Stoppcodon eine Mutation ist, die das TAG-Stoppcodon in ein TTG-Codon (Leucin) umwandelt. Daher ersetzen wir ein A-Nukleotid in der obigen Sequenz durch ein T-Nukleotid:GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTTGGACCCAGCTTTCTTGTACDer letzte Schritt besteht darin, diese Sequenz in die leere pENTR221-Sequenz einzufügen, die wir in SnapGene geöffnet haben. Konkret wählt man die 32 Nukleotide von 652 bis 687 aus und ersetzt sie durch die obige Sequenz. Voilà! Leider macht mir die Tatsache, dass die Linker nicht immer korrekt angegeben sind, ein ungutes Gefühl. Nach unserer eigenen Erfahrung enthalten die Bibliotheksreplikate des Orfeoms jedoch so viele Fehler, dass es ohnehin ratsam ist, das gesamte Insert mit T7- oder M13-Rev-Primern vom 3’-Ende und einem M13-Fwd-Primer vom 5’-Ende zu sequenzieren. Auf diese Weise können Sie eventuelle Linkerfehler aufdecken, die bei der Annotation der Klone unterlaufen sind.

Resistenz gegen Streptomycin und Spectinomycin

Sun, 11 Jan 2015 00:00:00 +0000

Viele cDNA-Klone aus der ORFeome-Gensammlung liegen im Plasmid pENTR223.1* vor. Um diese Klone zu züchten, verwenden die meisten Forscher Spectinomycin, da das Antibiotikaresistenzgen in den Karten der ORFeome-Kollaboration so bezeichnet wird und dies im Protokoll vorgeschrieben ist. Ein genauer Blick in die Literatur zeigt jedoch, dass derselbe Selektionsmarker mit Streptomycin ebenso gut funktionieren sollte. Nun, worin besteht der Unterschied? Hauptsächlich der Preis: Während 5 Gramm Spectinomycin von Sigma hier in Finnland 112,7 € kosten (Sigma 85555-5G) , kostet die gleiche Menge Streptomycin nur 17,80 €, also mehr als sechsmal weniger (Sigma S6501-5G) .Das Resistenzgen in pENTR223.1 ist das Aminoglykosid-Adenylyltransferase-Gen aadA (Streptomycin-3’’(9)-O-Nukleotidyltransferase; Aminoglykosid-3"-Adenylyltransferase (AAD(3”)(9); ANT(3”)(9)), das Resistenz sowohl gegen Spectinomycin als auch gegen Streptomycin verleiht. Es gibt jedoch verwandte Aminoglykosid-Adenylyltransferasen, die keine Resistenz gegen beide Antibiotika verleihen, sondern nur gegen das eine oder das andere. Daher müssen Sie genau wissen, welches Spektinomycin-Resistenzgen Ihr Plasmid trägt, wenn Sie Spektinomycin durch das kostengünstigere Streptomycin ersetzen möchten. Plasmidkarten sind oft nicht hilfreich: Ich habe gesehen, dass das aadA-Gen in pENTR223.1 mit SmR (Streptomycin-Resistenz, wie in SnapGene) oder SpnR (Spectinomycin-Resistenz, wie in den Karten aus der ORFeome-Sammlung) annotiert ist.Um experimentell zu prüfen, ob pENTR223.1 eine Resistenz gegen beide Antibiotika aufweist, habe ich ein Insert-haltiges pENTR223.1-Plasmid in 100 µg/ml Spectinomycin und 100 µg/ml Streptomycin gezüchtet, und es wuchs unter beiden Bedingungen gut, während der untransformierte E. coli-Elternstamm (NEB5-alpha) in keinem der beiden Medien wuchs. Allerdings sind die Unterschiede nicht immer eindeutig, wenn man verschiedene Konzentrationen dieser Antibiotika betrachtet. Aminoglykosid-Adenylyltransferasen, die Streptomycin/Spectinomycin inaktivieren, weisen bevorzugte, aber keine ausschließliche Substratspezifität auf. Das bedeutet, dass eine gewisse Resistenz gegen eine niedrige Streptomycin-Konzentration durch die Aminoglykosid-Adenylyltransferase vermittelt werden kann, die in erster Linie auf Spectinomycin abzielt (oder umgekehrt). In der Praxis sind einige von ihnen jedoch so exklusiv, dass es gerechtfertigt ist, sie entweder als SmR oder als SpnR einzustufen. Wenn Sie es wissen möchten, können Sie es jederzeit ausprobieren… Eine weitere Erkenntnis dabei war, dass der Negativselektionsmarker ccdB in XL1 Blue NICHT funktioniert, während er in NEB5-alpha sehr wohl funktioniert. Anscheinend funktioniert ccdB auch nicht in DH5alpha und JM109 (was ist der Unterschied zwischen DH5alpha und NEB5alpha?).* pENTR-223.1 wird aufgrund der beiden SfiI-Schnittstellen, die das Insert flankieren, auch als pDONR-223.1 oder pENTR223.1-Sfi bezeichnet. Man neigt dazu, das Plasmid vor dem Einbau der cDNA als pDONR und nach dem Einbau der cDNA als pENTR zu bezeichnen. Diese Namensgebung ist jedoch nicht überall einheitlich. Nach dem Einbau des Inserts (mithilfe der Gateway-BP-Reaktion) verliert der Vektor pDONR223.1 die Selektionsmarker ccdB und chlR/CmR, und das resultierende Backbone wird meist als pENTR223.1 bezeichnet.

Gateway on Michael’s Domain

Rekonstruktion der Sequenz eines Entry-Vektors (pENTR221) aus der OCAA-Bibliothek

Resistenz gegen Streptomycin und Spectinomycin