GE Healthcare on Michael’s Domain

Showdown: „Äkta“ von GE Healthcare gegen „NGC“ von Bio-Rad

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Seit 1996 beschäftige ich mich mit der Reinigung von Proteinen. Bis 2015 arbeitete ich mit einem Äkta Explorer, dann haben wir auf den Äkta Avant umgestellt. Im Jahr 2020 zog mein Labor um, und wir erhielten einen Bio-Rad NGC , den wir nun seit zwei Jahren nutzen.Wir hatten viele Probleme mit dem Bio-Rad NGC. Zunächst dachte ich, dass dies beim Systemwechsel vielleicht normal sei. Ich ging davon aus, dass die Probleme nach und nach verschwinden würden. Schließlich hatten wir auch Probleme, als wir vom Explorer auf den Avant umgestiegen sind.Doch selbst nach zwei Jahren und Dutzenden von Aufreinigungsläufen scheinen die Probleme mit dem NGC nicht aufzuhören. Immer wenn wir ein Problem lösen, taucht ein neues, bisher unbekanntes Problem auf. Und im Gegensatz zu GE Healthcare ist der Kundenservice von Bio-Rad nicht einmal annähernd so gut wie der, den wir von GE Healthcare gewohnt sind. Als unsere IT-Abteilung den Äkta nicht mit dem Netzwerk unserer Universität verbinden konnte, schickte GE Healthcare einen Techniker aus ihrem Münchner Team nach Helsinki, um das Problem zu beheben. In Anbetracht der Einarbeitungszeit bot GE Healthcare außerdem einem Mitarbeiter aus unserem Team die kostenlose Teilnahme an einem ihrer Kurse an. Und ihr Support beschränkte sich nicht auf die Garantiezeit! Sie wollten wirklich, dass wir mit ihrem Gerät zufrieden sind. Von Bio-Rad erfahren wir nicht das gleiche Maß an Unterstützung. Es fühlt sich immer so an, als müssten wir sie dazu zwingen, die Probleme zu lösen, die wir mit dem NGC haben, und ihre Reaktionszeit liegt weit unter jeglichen Kundenerwartungen.Dies ist der erste von mehreren Blogbeiträgen zum Thema „Äkta versus NGC“. Ich hoffe, dass ich in den nächsten Monaten die Zeit finden werde, ausführlicher über all unsere Probleme zu berichten.Wir haben 2015 beschlossen, dass wir endlich ein neues FPLC brauchten. Unser Äkta Explorer näherte sich dem Ende seiner Lebensdauer, und wir hatten rund 100.000 Fördermittel erhalten, um das FPLC unserer Zentraleinrichtung zu erneuern. Das Gerät war so teuer, dass wir das offizielle Ausschreibungsverfahren durchlaufen mussten (damals lag die Obergrenze bei 30.000 €, inzwischen wurde sie jedoch auf 60.000 € angehoben). Es gab nur zwei Mitbewerber: den Bio-Rad Discover NGC und den GE Healthcare Äkta Avant. Das Bio-Rad-Gerät war günstiger (82.810 € gegenüber 95.470 €), doch wir entschieden uns für den Kauf des Geräts von GE Healthcare. Ein wichtiger Grund dafür war, dass alle unsere Nutzer bisher den Äkta Explorer und dessen Unicorn-Software verwendet hatten. Ein Wechsel wäre einfach zu störend gewesen und hätte viel Unterstützung und Zeit unsererseits erfordert. Es gab jedoch auch technische Gründe, die uns dazu veranlassten, den Äkta dem NGC vorzuziehen: Vorteile des Äkta Avant

Erhöhte Widerstandsfähigkeit

Tue, 27 Nov 2018 00:00:00 +0000

Ich bin fest davon überzeugt, dass Unternehmen ein echtes Interesse daran haben, kritisches Feedback zu erhalten. Zumindest sollte dies Teil ihres unternehmerischen Überlebensinstinkts sein. Wenn unzufriedene Kunden einfach zu einem anderen Anbieter wechseln, ohne Feedback zu geben, ist der Schaden bereits angerichtet. Deshalb gebe ich immer Feedback, wenn ein Produkt meinen hohen Qualitätsansprüchen nicht gerecht wird. Dieses Mal schreibe ich jedoch über ein Produkt, mit dem ich sehr zufrieden bin, nämlich das neue GE Healthcare Superdex 75 Increase 10/300 GL . Es handelt sich um eine Gelfiltrationssäule und eine Weiterentwicklung des Vorgängermodells Superdex 75 10/300 GL , die wir seit 30 Jahren verwenden. Der größte Vorteil der „Increase“-Version ist die höhere Druckbeständigkeit. Vor einigen Wochen vergaß ein überarbeiteter Doktorand, die Säule nach dem Gebrauch zu verschließen, und stellte sie zurück in den Kühlschrank, wo das 20-prozentige Ethanol in den folgenden zwei Wochen langsam verdunstete. Der Kühlschrank ist belüftet, und als ich die Säule benötigte, war der Schaden bereits angerichtet: Es gab eine etwa 8 mm große Lücke, und es hatte sich eine trockene Zone von etwa einem Zoll gebildet. Ich füllte die Totvolumina sofort mit entgastem 20-prozentigem Ethanol auf und startete einen sehr langsamen Lauf (0,05 ml/min) über mehrere Stunden, woraufhin ich auf entgastes Wasser und anschließend auf Puffer umstellte. Nach etwa zwei Tagen Laufzeit hatte sich der Spalt auf etwa 3 Millimeter verringert. Der verbleibende Spalt wurde durch Justieren des oberen Adapters beseitigt (ich musste ihn so weit wie möglich festschrauben). Nun musste ich die „reparierte“ Säule testen. Ich führte sowohl einen Funktionstest (Trennung zweier Proteine in PBS) als auch den Aceton-Test (Injektion von 100 µl 2-prozentigem Aceton in Wasser) durch. Ich war äußerst überrascht, als der Aceton-Test etwa 19.000 theoretische Platten anzeigte (das ist mehr, als wir jemals mit unseren alten Superdex-75-Säulen erreicht haben). Und die Trennung der beiden Proteine (RNaseA und BSA) zeigte, dass die Säule nach wie vor voll funktionsfähig ist. Allerdings können wir keinerlei Gelkompression tolerieren, da die Korrekturkapazität des Adapters bereits voll ausgeschöpft ist (GE Healthcare stellte früher einen längeren Adapter her, mit dem wir noch mehr kompensieren könnten, aber das Unternehmen hat beschlossen, dieses Produkt aus dem Programm zu nehmen).Sowohl der Doktorand als auch ich waren nach Erhalt dieser Ergebnisse erleichtert, da der Kauf einer neuen Säule uns 2.200 € gekostet hätte und wir über keine zweckgebundenen Mittel für den Betrieb unserer Zentraleinrichtung haben, wäre ich gezwungen gewesen, diese Kosten auf das Labor des Doktoranden abzuwälzen. Leider habe ich kein Foto von der beschädigten Säule gemacht, da meine instinktive Reaktion darin bestand, sofort mit der Bergung zu beginnen. Die Säule auf dem Bild unten ist jedoch die beschädigte Säule, nachdem die Bergungsaktion abgeschlossen war.

Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Wir organisieren (erneut) einen praxisorientierten Kurs zur Proteinreinigung vom 4. bis zum 20. Dezember. Wir können maximal 16 Teilnehmer aufnehmen, die in Gruppen von 2 bis 4 Teilnehmern eingeteilt werden. Jede Gruppe benötigt drei volle Tage, um die praktischen Übungen durchzuführen, wobei sich der dritte Tag des Kurses mit dem ersten Tag der nächsten Gruppe überschneidet. Veranstaltungsort ist das Biomedicum Helsinki, Räume A516a1 (wo sich die Geräte befinden) und B318a/b (unser Labor). Wir werden ein Protein (VEGF-Rezeptor 3) mithilfe eines zweistufigen Protokolls (Affinitätschromatographie + Gelfiltration) auf dem Äkta Avant FPLC-Gerät aufreinigen. Am dritten Kurstag werden wir die Wechselwirkung dieses Proteins mit seinem Liganden (VEGF-C) auf dem ITC-Gerät (isotherme Kalorimetrie) untersuchen. Wir haben bereits 2015 einen ähnlichen Kurs angeboten ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Dieser neue Kurs ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) wird einen ähnlichen Aufbau haben, wir erweitern ihn jedoch um einen Tag, um Protein-Wechselwirkungen mithilfe des neuen Isothermischen-Kalorimetrie-Geräts unserer B3P-Kernanlage zu analysieren. Die Dokumentation und die Ergebnisse werden ebenfalls hier verfügbar sein.Da wir maximal zwei Proben gleichzeitig bearbeiten können (wir verfügen „nur“ über zwei FPLC-Geräte), müssen wir die Teilnehmer in Gruppen (mit jeweils 2–4 Studierenden) aufteilen und den dreitägigen Kurs je nach Teilnehmerzahl mehrmals wiederholen.

Unicorn 7-Benutzer-Einrichtung erfordert manuelle Intervention in einer Netzwerkbenutzer-Umgebung

Fri, 17 Jun 2016 00:00:00 +0000

Unicorn, Äkta Avant, Äkta Explorer, GE Healthcare, Windows, Netzwerkauthentifizierung, Benutzereinrichtung, Methode, Ergebnis, Wissenschaft, Proteinreinigung Da wir unser Äkta Avant in einer Mehrbenutzerumgebung betreiben, müssen wir die Methoden und Ergebnisse der verschiedenen Benutzer voneinander trennen. Standardmäßig kann derzeit jeder Netzwerkbenutzer alle Methoden und Ergebnisse einsehen, die von einem anderen Netzwerkbenutzer auf dem Gerät erstellt wurden. Dies stellt ein erhebliches Datenschutz- und Sicherheitsrisiko dar, da ein böswilliger Benutzer Methoden und Ergebnisse löschen (oder schlimmer noch: verändern) könnte.Unser Äkta ist so eingerichtet, dass sich Benutzer mit ihrem Universitäts-Login und -Passwort über den regulären Windows-Netzwerkauthentifizierungsmechanismus am Unicorn-7-Computer anmelden können. Wenn sich jedoch mehrere Personen die Verantwortung für einen Durchlauf teilen, ist diese Konfiguration nicht mehr möglich, da sie sich gegenseitig ihre Passwörter mitteilen müssten. Daher haben wir ein lokales Konto eingerichtet, das von Benutzern genutzt werden kann, die sich die Bedienung des Äkta-Geräts teilen möchten. Nach der Anmeldung bei Windows müssen sich die Benutzer noch bei der Unicorn-7-Software anmelden, was sie mit ihrem Hochschul-Benutzernamen und -Passwort tun („Windows-Authentifizierung“). Bei dieser Konfiguration kann jeder Benutzer alle Methoden und Ergebnisse einsehen, was nicht akzeptabel ist. Beim Einrichten eines neuen Benutzers in Unicorn (unter „Zugriff > Ordner“) konnte genau festgelegt werden, auf welche Ordner dieser Benutzer Zugriff hatte, und der Benutzer sah nur seine eigenen Methoden und Ergebnisse. Da die Ordnerstruktur unter Unicorn 5 der Ordnerstruktur des Windows-Dateisystems entsprach, konnten Benutzer Methoden und Ergebnisse jederzeit von einem Ordner in einen anderen kopieren und sie so trotz der vom Unicorn-5-Programm festgelegten Einschränkungen verfügbar machen.Als ich zum ersten Mal las, dass Unicorn 7 die Windows-Netzwerkauthentifizierung unterstützt, hatte ich gehofft, dass wir die mühsame Benutzereinrichtung vermeiden könnten, die wir für jeden Benutzer auf dem Äkta Explorer durchführen mussten. Doch die Mühen gehen weiter, da die einmalige Einrichtung der Benutzerrechte für eine Gruppe uns keine Benutzerisolierung bietet.Erstens kann man in Unicorn 7 nicht den Zugriff einzelner Benutzer einschränken, sondern nur den Zugriff von Gruppen. Wir mussten für jeden Netzwerkbenutzer eine Zugriffsgruppe anlegen, den Netzwerkbenutzer dieser Gruppe hinzufügen, einen separaten Home-Ordner für die Gruppe erstellen und dann den Ordnerzugriff auf diesen Home-Ordner beschränken. Für eine Handvoll Benutzer waren Hunderte von Klicks erforderlich, da standardmäßig kein Zugriff auf irgendetwas besteht und jedes einzelne Kontrollkästchen für Berechtigungen – mit Ausnahme der Administratorrechte – aktiviert werden muss. In dieser Hinsicht ist Windows (und jedes andere Betriebssystem) weitaus intelligenter als Unicorn. Wenn sich ein Universitätsmitarbeiter an einem Rechner anmeldet, an dem er sich noch nie zuvor angemeldet hat, erstellt das System automatisch die gesamte erforderliche lokale Standardordnerstruktur und bindet den privaten Home-Ordner dieses Benutzers ein, ohne Zugriff auf alles zu gewähren, was andere Mitarbeiter auf diesem bestimmten Rechner bisher getan haben. Ich denke, das sollte auch bei Unicorn eine Option sein. Vielleicht gibt es diese Option ja und ich finde sie nur nicht? Ein weiterer großer Nachteil der oben beschriebenen Methode, jeden Benutzer in eine eigene Zugriffsgruppe zu ordnen, ist, dass die Anmeldung bei Unicorn zu einer echten Tortur wird: Zusätzlich zur Eingabe von Benutzername und Passwort muss der Benutzer die richtige Zugriffsgruppe auswählen, damit die Anmeldung erfolgreich ist. Und noch schlimmer: In unserer Konfiguration lässt es sich nicht vermeiden, dass jeder Universitätsmitarbeiter zwei Zugriffsgruppen angehört: einer manuell angelegten Zugriffsgruppe für jeden Benutzer zur Benutzertrennung und der „Standardgruppe“, die über die Windows-Netzwerkauthentifizierung funktioniert – vielleicht Kerberos? Wenn Benutzer also die Standardzugriffsgruppe wählen (die in unserem Fall „Users“ heißt), können sie sich zwar anmelden, sehen aber ihre Methoden und Ergebnisse nicht.Es gibt zwei Gründe, warum wir die Zugriffsgruppe „Users“ nicht löschen können: Zum einen ist dies eine Vorgabe der Fakultät, und zum anderen (und das haben wir versucht) können wir sie nicht mehr löschen, da bereits viele Personen Methoden angelegt und Ergebnisse generiert haben, während sie der Zugriffsgruppe „Users“ angehörten. Daher verhindert UNICORN, dass wir dieses Konto löschen können. Ich arbeite an diesem Problem: Ich sollte direkt auf die zugrunde liegende MS-SQL-Datenbank zugreifen können, um die Eigentumsrechte an den Methoden und Ergebnissen zu ändern. Allerdings war GE nicht gerade auskunftsfreudig, als ich nach der Handhabung von Zugriffsrechten fragte. Die Antwort lautete: Die Zugangsdaten für die Datenbank in einer eigenständigen UNICORN-Lösung sind verschlüsselt und nicht öffentlich zugänglich. Wenn Sie eine Enterprise-Lösung hätten (mit einer eigenen (SQL-Server-)Datenbank), hätten Sie die Kontrolle über die Zugangsdaten und könnten theoretisch die gewünschten Informationen extrahieren (das Format müssen Sie selbst herausfinden; es wird von uns nicht unterstützt). Sie können Ihre Lösung auf eine Enterprise-Version upgraden, wenn Sie möchten. Das klingt schlimmer, als es ist, da wir physischen Zugriff auf den MS-SQL-Server haben und das Extrahieren der Zugangsdaten nicht besonders schwierig zu sein scheint. Aber es kostet mich Zeit, die Schwachstelle zu finden, um „in unser eigenes System einzudringen“, und genau das ärgert mich. Laut Lisa Bromark von GE scheint das Update 7.0.2 dieses Problem jedoch zu beheben: UNICORN kann so konfiguriert werden, dass ein neues Datenbankpasswort verwendet wird. Es ist möglich, ein verschlüsseltes Passwort zu generieren oder ein bereits verschlüsseltes Passwort einzugeben. Dies geschieht durch Ausführen des UNICORN Service Tools nach der Installation von UNICORN.Allerdings ist es unglaublich schwierig, das Update zu bekommen (zumindest scheint es Wochen zu dauern). Die Verteilung erfolgt offenbar immer noch über optische Datenträger und per Post. Ich glaube, das letzte Mal, dass ich mir Software auf einer CD/DVD besorgt habe, ist mehr als 10 Jahre her. GE teilte mir jedoch mit, dass sie gerade dabei sind, die UNICORN-Software-Updates auf „elektronischen Vertrieb“ umzustellen. Willkommen im 21. Jahrhundert!

Die Benutzertrennung in Unicorn 7 erfordert manuelle Eingriffe in einer Netzwerkbenutzerumgebung

Mon, 09 May 2016 00:00:00 +0000

Da wir unseren Äkta Avant in einer Mehrbenutzerumgebung betreiben, müssen wir die Methoden und Ergebnisse der verschiedenen Benutzer voneinander trennen. Standardmäßig kann derzeit jeder Netzwerkbenutzer alle Methoden und Ergebnisse einsehen, die von einem anderen Netzwerkbenutzer auf dem Gerät erstellt wurden. Dies stellt ein erhebliches Datenschutz- und Sicherheitsrisiko dar, da ein böswilliger Benutzer Methoden und Ergebnisse löschen (oder schlimmer noch: verändern) könnte.Unser Äkta ist so eingerichtet, dass sich Benutzer mit ihrem Universitäts-Login und -Passwort über den regulären Windows-Netzwerkauthentifizierungsmechanismus am Unicorn-7-Computer anmelden können. Wenn sich jedoch mehrere Personen die Verantwortung für einen Lauf teilen, ist diese Konfiguration nicht mehr möglich, da sie sich gegenseitig ihre Passwörter mitteilen müssten. Daher haben wir ein lokales Konto eingerichtet, das von Benutzern genutzt werden kann, die sich die Bedienung des Äkta-Geräts teilen möchten. Nach der Anmeldung bei Windows müssen sich die Benutzer noch bei der Unicorn-7-Software anmelden, was sie mit ihrem Hochschul-Benutzernamen und -Passwort tun („Windows-Authentifizierung“). Bei dieser Konfiguration kann jeder Benutzer alle Methoden und Ergebnisse einsehen, was nicht akzeptabel ist. Beim Einrichten eines neuen Benutzers in Unicorn (unter „Zugriff > Ordner“) konnte genau festgelegt werden, auf welche Ordner dieser Benutzer Zugriff hatte, und der Benutzer sah nur seine eigenen Methoden und Ergebnisse. Da die Ordnerstruktur unter Unicorn 5 der Ordnerstruktur des Windows-Dateisystems entsprach, konnten Benutzer Methoden und Ergebnisse jederzeit von einem Ordner in einen anderen kopieren und sie so trotz der vom Unicorn-5-Programm festgelegten Einschränkungen verfügbar machen.Als ich zum ersten Mal las, dass Unicorn 7 die Windows-Netzwerkauthentifizierung unterstützt, hatte ich gehofft, dass wir die mühsame Benutzereinrichtung vermeiden könnten, die wir für jeden Benutzer auf dem Äkta Explorer durchführen mussten. Doch die Mühen gehen weiter, da die einmalige Einrichtung der Benutzerrechte für eine Gruppe uns keine Benutzerisolierung bietet.Erstens kann man in Unicorn 7 nicht den Zugriff einzelner Benutzer einschränken, sondern nur den Zugriff von Gruppen. Wir mussten für jeden Netzwerkbenutzer eine Zugriffsgruppe anlegen, den Netzwerkbenutzer dieser Gruppe hinzufügen, einen separaten Home-Ordner für die Gruppe erstellen und dann den Ordnerzugriff auf diesen Home-Ordner beschränken. Für eine Handvoll Benutzer waren Hunderte von Klicks erforderlich, da standardmäßig kein Zugriff auf irgendetwas besteht und jedes einzelne Kontrollkästchen für Berechtigungen – mit Ausnahme der Administratorrechte – aktiviert werden muss. In dieser Hinsicht ist Windows (und jedes andere Betriebssystem) weitaus intelligenter als Unicorn. Wenn sich ein Universitätsmitarbeiter an einem Rechner anmeldet, an dem er sich zuvor noch nie angemeldet hat, erstellt das System automatisch die gesamte erforderliche lokale Standardordnerstruktur und bindet den privaten Home-Ordner dieses Benutzers ein, ohne Zugriff auf alles zu gewähren, was andere Mitarbeiter auf diesem bestimmten Rechner bisher getan haben. Ich denke, das sollte auch bei Unicorn eine Option sein. Vielleicht gibt es diese Option ja und ich finde sie nur nicht? Ein weiterer großer Nachteil der oben beschriebenen Methode, jeden Benutzer in eine eigene Zugriffsgruppe zu ordnen, ist, dass die Anmeldung bei Unicorn zu einer echten Tortur wird: Zusätzlich zur Eingabe von Benutzername und Passwort muss der Benutzer die richtige Zugriffsgruppe auswählen, damit die Anmeldung erfolgreich ist. Und noch schlimmer: In unserer Konfiguration lässt es sich nicht vermeiden, dass jeder Universitätsmitarbeiter zwei Zugriffsgruppen angehört: einer manuell angelegten Zugriffsgruppe für jeden Benutzer zur Benutzertrennung und der „Standardgruppe“, die über die Windows-Netzwerkauthentifizierung funktioniert – vielleicht Kerberos? Wenn Benutzer also die Standardzugriffsgruppe wählen (die in unserem Fall „Users“ heißt), können sie sich zwar anmelden, sehen aber ihre Methoden und Ergebnisse nicht.Es gibt zwei Gründe, warum wir die Zugriffsgruppe „Users“ nicht löschen können: Zum einen ist dies eine Vorgabe der Fakultät, und zum anderen (und das haben wir versucht) können wir sie nicht mehr löschen, da bereits viele Personen Methoden angelegt und Ergebnisse generiert haben, während sie der Zugriffsgruppe „Users“ angehörten. Daher verhindert UNICORN, dass wir dieses Konto löschen können. Ich arbeite an diesem Problem: Ich sollte direkt auf die zugrunde liegende MS-SQL-Datenbank zugreifen können, um die Eigentumsrechte an den Methoden und Ergebnissen zu ändern. Allerdings war GE nicht gerade auskunftsfreudig, als ich nach der Handhabung von Zugriffsrechten fragte. Die Antwort lautete: Die Zugangsdaten für die Datenbank in einer eigenständigen UNICORN-Lösung sind verschlüsselt und nicht öffentlich zugänglich. Wenn Sie eine Enterprise-Lösung hätten (mit einer eigenen (SQL-Server-)Datenbank), hätten Sie die Kontrolle über die Zugangsdaten und könnten theoretisch die gewünschten Informationen extrahieren (das Format müssen Sie selbst herausfinden; es wird von uns nicht unterstützt). Sie können Ihre Lösung auf eine Enterprise-Version upgraden, wenn Sie möchten. Das klingt schlimmer, als es ist, da wir physischen Zugriff auf den MS-SQL-Server haben und das Extrahieren der Zugangsdaten nicht besonders schwierig zu sein scheint. Aber es kostet mich Zeit, die Schwachstelle zu finden, um „in unser eigenes System einzudringen“, und genau das ärgert mich. Laut Lisa Bromark von GE scheint das Update 7.0.2 dieses Problem jedoch zu beheben: UNICORN kann so konfiguriert werden, dass ein neues Datenbankpasswort verwendet wird. Es ist möglich, ein verschlüsseltes Passwort zu generieren oder ein bereits verschlüsseltes Passwort einzugeben. Dies geschieht durch Ausführen des UNICORN Service Tools nach der Installation von UNICORN.Allerdings ist es unglaublich schwierig, das Update zu bekommen (zumindest scheint es Wochen zu dauern). Die Verteilung erfolgt offenbar immer noch über optische Datenträger und per Post. Ich glaube, das letzte Mal, dass ich mir Software auf einer CD/DVD besorgt habe, ist mehr als 10 Jahre her. GE teilte mir jedoch mit, dass sie gerade dabei sind, die UNICORN-Software-Updates auf „elektronischen Vertrieb“ umzustellen. Willkommen im 21. Jahrhundert!

Die Funktionsweise des Äkta Avant-Fraktionssammlers

Mon, 02 May 2016 00:00:00 +0000

Nachdem wir alle Anlaufschwierigkeiten mit unserem Äkta Avant behoben haben, trauen wir uns endlich, ihn unseren Kunden zur Nutzung zu überlassen. Unsere Kunden sind sehr heterogen und reichen von absoluten Neulingen im Bereich FPLC bis hin zu erfahrenen Äkta-Explorer-Anwendern (und allem, was dazwischen liegt). Wenn wir GE Feedback gegeben haben, war unsere Perspektive natürlich auf einen bestimmten Nutzertyp ausgerichtet. Die Betreuung unserer Kunden eröffnet uns nun jedoch eine neue Perspektive, da wir mit den Usability-Problemen konfrontiert werden, die sie nicht selbst lösen können. An dieser Stelle möchte ich nur einen Stolperstein erwähnen, der uns immer wieder aufgefallen ist: die Logik hinter der Funktionsweise des Fraktionssammlers. Anders als bei den älteren Systemen lässt sich der Fraktionssammler nicht manuell auf die „erste Position“ oder eine beliebig definierte Position zurücksetzen, wie es beispielsweise unter Unicorn 5 möglich war.Wir selbst haben eine ganze Weile gebraucht, um uns an die interne Logik des Fraktionssammelprozesses zu gewöhnen, und benötigten dabei Unterstützung von GE. Dass sich das System nicht intuitiv verhält, wird durch die Tatsache unterstrichen, dass einige der Antworten, die wir von GE-Experten erhielten, unvollständig waren (was für uns zu einigen unangenehmen Probenverlusten führte). Schließlich erhielten wir vom GE-Support eine Tabelle, die das Verhalten des Fraktionssammlers beschreibt (siehe unten). Allerdings ist auch diese Tabelle unvollständig, und wir haben einige Zeilen hinzugefügt, die bestimmte nicht standardmäßige Situationen beschreiben, für die die Tabelle keine Antwort bietet. Diese Änderungen und Ergänzungen zur Beschreibung von GE sind rot markiert.

Leistung der HiLoad 26/60 Superdex PG-Gelfiltrationschromatographie-Säule

Mon, 11 Apr 2016 00:00:00 +0000

Die von uns am häufigsten verwendete Technik zur Proteinreinigung ist die Gelfiltration (auch als Größenausschlusschromatographie bezeichnet). Bei der Gelfiltration werden Proteine nach ihrer Größe getrennt (genauer gesagt nach ihrem „Stokes-Radius“, der weitgehend von ihrer Größe und Form bestimmt wird). Für die Gelfiltration großer Proteinmengen haben wir vor etwa 9 Jahren die HiLoad 26/60 Superdex 200 Prep Grade von GE Healthcare erworben (das Modell 26/60 wurde inzwischen durch das HiLoad 26/600 ersetzt, beide sind jedoch nahezu identisch). Mit dieser Säule lassen sich zwei Proteine, deren Größenunterschied 100 % beträgt, sehr sauber trennen. Daher eignet sie sich zur Trennung von monomeren und dimeren Formen desselben Proteins. Das „Verfallsdatum“ der Säule war März 2012. Nach unserer Erfahrung kann eine solche Säule bei sachgemäßer Handhabung problemlos eine Lebensdauer von 10 bis 15 Jahren erreichen (wir verwenden sie nicht sehr oft, lagern sie in 20 %igem Ethanol und bewahren sie bei +4 °C auf, wenn wir sie über längere Zeit nicht benötigen).

Testbericht zum Äkta Avant 25 von GE Healthcare

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Vor etwa einem Jahr haben wir im Rahmen einer internen Ausschreibung der Fakultät Fördermittel erhalten, um das alte Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC-Gerät der Zentrale Einrichtung für Proteinproduktion und -reinigung zu ersetzen. Der Äkta Explorer war 1996(?) angeschafft worden, als die schwedische Marke Pharmacia noch existierte. Im Jahr 2014 trat das Worst-Case-Szenario ein: Sowohl der Monochromator als auch Xenon-Blitzlampe fast gleichzeitig ausfielen, was uns eine Rechnung von fast 10.000 € bescherte. Daher wollten wir das Gerät durch ein modernes Modell ersetzen. Es gibt nur zwei Unternehmen, die in diesem Bereich seriöse Geräte anbieten, nämlich GE Healthcare ( Äkta-Produktreihe ) und BioRad ( NGC-Produktreihe ). GE Healthcare hat die Marke Äkta im Zuge mehrerer Fusionen von Pharmacia übernommen, während BioRad mit seinen NGC-Modellen, die erst vor wenigen Jahren auf den Markt kamen, ein relativ neuer Wettbewerber ist.Wir haben uns für das Äkta Avant 25 entschieden. Wir wollten auf jeden Fall einen gekapselten, gekühlten Fraktionssammler haben. Außerdem war uns eine vertraute Benutzererfahrung wichtig. Wir führen häufig automatisierte Aufreinigungen durch und möchten nicht, dass unsere Proteine längere Zeit bei Raumtemperatur in offenen Röhrchen stehen, in die Bakterien und Staub aus der Luft eindringen können. Mittlerweile setzen wir den Äkta Avant seit etwa einem halben Jahr ein und haben inzwischen einen guten Eindruck davon, wie er im Vergleich zum Äkta Explorer abschneidet. Obwohl der Avant moderner ist als der Explorer, nutzen alle Anwender unserer Zentraleinrichtung nach wie vor den Explorer. Sie sind mit der Benutzeroberfläche von Unicorn 5.11 vertraut und haben offenbar kein Interesse daran, sich in die – zugegebenermaßen – kompliziertere Benutzeroberfläche des Avant einzuarbeiten. Ein weiterer Grund dafür, dass das Gerät bisher nur intern genutzt wurde, war jedoch die beträchtliche Anzahl an Problemen, auf die wir gestoßen sind. Bei unserem alten Äkta Explorer haben wir noch nie so viele Probleme in so kurzer Folge erlebt. Ich weiß nicht, ob unsere Situation typisch ist (laut den Vertretern von GE Healthcare ist dies nicht der Fall). Dennoch sind hier die Probleme aufgeführt, auf die wir gestoßen sind:

FPLC-Kurs zur Proteinreinigung

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Acht Doktoranden hatten sich für den FPLC-Kurs zur Proteinreinigung angemeldet, der im Dezember stattfand. Wenn ich etwas gelernt habe, dann, dass die Proteinreinigung im Rahmen eines Kurses IMMER mit einem Protein und einem Protokoll durchgeführt werden sollte, die bereits VIELE Male erfolgreich angewendet wurden. Von den Studierenden mitgebrachte Proteine sind eine hervorragende Lernquelle, doch die zeitlichen Einschränkungen eines Kursformats erlaubten es uns nicht, die Aufreinigung dieser Proteine noch während des Kurses abzuschließen.Technische Probleme mit dem neuen Äkta Avant 25Zudem war das Äkta Avant 25 , die wir diesen Sommer neu bei GE Healthcare erworben hatten, fiel während des Kurses ZWEIMAL aus. Zunächst fiel der Steuerungscomputer aus (RAID-Ausfall). HP lieferte die Ersatzfestplatte innerhalb von 24 Stunden, und nachdem sich das RAID wiederhergestellt hatte, konnten wir den Kurs fortsetzen. Beim ersten Durchlauf nach diesem Vorfall trat beim Äkta jedoch ein Überdruckproblem auf. Wir identifizierten einen defekten Durchflussbegrenzer als Ursache identifiziert, wollten den Lauf jedoch nicht fortsetzen, da wir bei früheren Durchläufen bereits schwerwiegende Probleme mit Luftblasen hatten. Daher führten wir die Durchläufe auf dem alten Äkta Explorer 100 durch. GE Healthcare ließ das System umgehend von einem Servicetechniker überprüfen, doch da dieser kein Ersatzgerät dabei hatte, mussten wir bis Montag, den 14.12., warten, bis der Äkta Avant wieder voll funktionsfähig war.Was wir aufgereinigt haben: lösliches VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) und HepsinWir haben lösliches humanes VEGF-Rezeptor-3 aufgereinigt (die ersten drei Domänen seiner extrazellulären Domäne, verbunden mit dem konstanten Fc-Teil von humanem IgG). Diese Aufreinigung haben wir bereits mehrfach durchgeführt. Sie entspricht der Aufreinigung von Antikörpern mit Protein-A-Sepharose.Wir hatten im Vorfeld konditioniertes Zellkulturmedium vorbereitet. Wir produzieren die meisten unserer Proteine in Insektenzellen (hauptsächlich Drosophila S2), und das VEGFR-3/Fc war von den S2-Zellen nach Induktion des Metallothionein-Promotors mit 1 mM Cu²⁺ über etwa 4,5 Tage hinweg in das Medium sekretiert worden. Die Vorbereitung des Mediums für die Aufreinigung besteht lediglich aus 1) dem Entfernen der Zellen durch Zentrifugation und 2) der Filtration, um Präzipitate und andere kleine Partikel zu entfernen, die die Säule verstopfen könnten. Eine Anpassung des pH-Werts ist nicht erforderlich.Eine schnelle Neutralisierung nach der Elution bei niedrigem pH-Wert IST WICHTIGWir haben das Medium über eine Einweg-5-ml- HiTrap-Rekombinant-Protein-A-Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von etwa 1 ml/min und eluierten es mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Die eluierten 2-ml-Fraktionen wurden sofort mit 400 µl 1 M Tris (pH 8,5) neutralisiert. Hier unterlief uns bei einer der beiden Aufreinigungen ein kleiner Fehler. GE Healthcare hatte die Kassetten für die 5-ml-Sammelröhrchen noch nicht freigegeben (dies ist bis heute nicht geschehen, obwohl sie bereits für September 2015 versprochen worden waren), und wir verwendeten 15-ml-Falcon-Röhrchen zur Sammlung der 2-ml-Fraktionen, in die wir zuvor 400 µl der Neutralisationslösung alikvotiert hatten. Allerdings war die Durchmischung in diesen Röhrchen nicht effizient, und die längere Einwirkung eines niedrigen pH-Werts führte zu einer teilweisen Schädigung unseres Proteins. Dies lässt sich beim Vergleich der Größenausschluss-Chromatogramme von Gruppe 2 mit denen von Gruppe 4 erkennen: Bei Gruppe 4 ist der erste Peak (aggregiertes Protein) im Vergleich zum entsprechenden Peak bei Gruppe 2 deutlich größer und heterogener. Tatsächlich fällt VEGFR-3/Fc, wenn es bei niedrigem pH-Wert aus Protein-A-Säulen eluiert wird, bei höheren Konzentrationen kurz nach der Elution stets aus, löst sich jedoch bei Neutralisation wieder auf. Dies geschah in den Fraktionen 5.A.3 und 5.A.4 (Gruppe 4) nicht, da sich Eluat und Neutralisationspuffer im 15-ml-Falcon-Röhrchen nicht ausreichend vermischten (wahrscheinlich trug auch die Fraktionsgröße von 2 ml dazu bei; 1 ml wäre besser gewesen). Während des Laufs für Gruppe 2 haben wir die Röhrchen unmittelbar nach Beendigung des Laufs entnommen und dadurch die Puffer vermischt, während der Lauf für Gruppe 4 über Nacht endete und das Eluat bis zum Morgen weitgehend unvermischt blieb.Alternativ hätten wir mit einem hochkonzentrierten chaotropen Salz bei nahezu neutralem pH-Wert eluieren können (was wir beim nächsten Mal tun werden, falls wir einen automatisierten Lauf haben, bei dem die Elution mitten in der Nacht stattfindet). Pierce bietet einen (proprietären) „sanften“ Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 6,6 an. Ich kenne die Zusammensetzung des Pierce-Puffers nicht, aber es handelt sich um eine hochkonzentrierte Lösung eines chaotropen Salzes. 3 M Kalium-/Natriumthiocyanat oder 4 M Magnesiumchlorid in gepufferten Lösungen um pH 7 sind häufig verwendete chaotrope Salze für diesen Zweck. Hepsin Die von den Studierenden bereitgestellten Proteine stellten eine Herausforderung dar. Erstens war ihre Konzentration im Ausgangsmaterial sehr gering. Während wir das Protein deutlich erkennen können, wenn das VEGFR-3/Fc-konditionierte Medium auf einem PAGE-Gel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt wird, ist für das Hepsin kein solches Band sichtbar. Zudem schien ein erheblicher Anteil des Proteins das Histag (nicht mehr) zu enthalten und wird daher im ersten Reinigungsschritt nicht aufgefangen. Der Anteil an Hepsin-H6, der an Ni²⁺-Sepharose bindet, eluiert bereits bei einer Imidazol-Konzentration von 20 mM, was das Waschen der Säule erschwert. Das Hepsin mit dem längeren Histag (H10) übersteht die 20 mM Imidazol-Waschung zwar, weist jedoch ebenfalls niedrige Expressionsniveaus auf. Nachfolgend sind die Chromatogramme der einzelnen Durchläufe sowie die kommentierten Bilder der mit Coomassie gefärbten PAGE-Gele dargestellt. Das detaillierte Protokoll für den Betrieb des Äkta Avant 25 befindet sich noch in Vorbereitung…

So konvertieren Sie EMF-Dateien in das SVG-Format

Tue, 06 Mar 2007 00:00:00 +0000

Der Bedarf dafür ergab sich, weil die Unicorn-Software, die unseren Äkta Explorer steuert, die chromatographischen Rohkurven nur im EMF-Format exportieren kann. Echt erbärmlich. Nachdem ich verschiedene Möglichkeiten ausprobiert hatte, entschied ich mich für OpenOffice. OpenOffice Draw kann EMF-Dateien importieren und als SVG speichern. Andere Anwendungen, die EMF-Dateien öffnen können, sind FreeHand und CorelDraw (getestet auf Macintosh). FreeHand kann jedoch nicht als SVG exportieren.