Rekonstruktion der Sequenz eines Entry-Vektors (pENTR221) aus der OCAA-Bibliothek

Fri, 30 Oct 2020 00:00:00 +0000

Dieser Artikel richtet sich an Personen, die sich mit molekularer Klonierung beschäftigen. Genauer gesagt an diejenigen, die mit Gateway-Vektoren arbeiten. Nehmen wir an, Sie haben von jemandem einen Gateway-Klon erhalten. Sie kennen die Insertsequenz und Sie kennen das Backbone. Eines der gängigsten Backbones ist pENTR221. Nehmen wir als Beispiel das Insert der humanen CTSL1-cDNA, genauer gesagt den Klon mit der ID 100010639 aus der OCAA-Klon-Sammlung. Die Insert-Sequenz kennen Sie anhand der Zugangsnummer (BC012612).Sie benötigen die vollständige DNA-Sequenz dieses Vektors, um eine intelligente Klonierungssoftware wie SnapGene zur Unterstützung Ihres Klonierungsdesigns nutzen zu können. Diese Software setzt jedoch voraus, dass Sie über die vollständige Sequenz des Konstrukts (oder zumindest über die vollständigen Sequenzen seiner wichtigen Teile) verfügen. Wie finden Sie also die vollständige Sequenz des pENTR221-CTSL1-Klons heraus? Die Insertsequenz können Sie bei NCBI abrufen: Geben Sie einfach die Zugangsnummer ein, die Sie für Ihren Klon erhalten haben. Lade die Sequenz im Fasta- oder Genbank-Format herunter. Interessanterweise kennt die ansonsten so leistungsfähige SnapGene-Software den pENTR221-Vektor nicht. Du musst also nach dem Vektor-Backbone „pENTR221 DNA-Sequenz“ googeln. Sie erhalten viele Treffer; hier sind nur vier davon: 1. http://dnasu.org/DNASU/GetVectorDetail.do?vectorid=2792 . https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=279 3. https://www.genomics-online.com/vector-backbone/48/pentr221/4 . http://yrgene.com/documents/vector/pentr221.pdfMatthias : Der Autor der vierten Quelle stellt die Sequenz in einer PDF-Datei zur Verfügung, was nicht empfehlenswert ist. Wenn Sie die DNA-Sequenz aus dieser Datei kopieren, wird sie völlig durcheinandergebracht, da PDF die Gruppierungen von jeweils 10 Nukleotiden nicht zeilenweise ausliest. Lieber Matthias, verwenden Sie kein PDF zur Verbreitung oder Dokumentation von DNA-Sequenzen! Wenn du es dennoch tun MUSST, füge dem PDF bitte eine reine Textdatei mit der Nukleotidsequenz als Anhang hinzu! Natürlich kannst du die DNA-Sequenz mit einem leistungsfähigen PDF-Tool wie PDF Studio Pro in der richtigen Reihenfolge extrahieren. Aus irgendeinem seltsamen Grund weicht die Sequenz der dritten URL von den anderen vier ab, da sie als einzige die vollständigen Verbindungsstellen (attL1 und attL2) enthält. Es spielt jedoch keine Rolle, welche der Sequenzen du für den Assembly verwendest, da die Unterschiede alle in dem Bereich liegen, der während des Assembly-Prozesses entfernt wird (ich weiß nicht, wie der pENTR221-Vektor für das Bibliotheksklonieren in meinem konkreten Beispiel vorbereitet wurde, aber es sieht für mich so aus, als wäre der ursprüngliche Vektor mit einem einzigen DraI-Schnitt (der stumpfe Enden erzeugt) geöffnet worden und dann wären zuerst die Linker und danach das Insert hinzugefügt worden. Ich schlage vor, dass du die Sequenz aus der dritten URL verwendest (da sie im Fasta-Format vorliegt), sie in SnapGene importierst und SnapGene gemeinsame Merkmale erkennen lässt. Nun brauchst du noch den Linker. Woher weißt du, welcher Linker verwendet wurde? Wir beziehen die meisten unserer Gateway-Klone aus einer hauseigenen Nachbildung der OCAA-Klonsammlung, und du kannst die vollständige Liste der Klone als Excel-Tabelle hier herunterladen. Die Daten enthalten für jeden Klon die verwendeten Linker (es gibt 8 verschiedene 5’-Linker und 16 verschiedene 3’-Linker). Leider scheint diese Excel-Tabelle einige Fehler zu enthalten, da manche Linker ein Stoppcodon enthalten, aber dennoch als „ohne Stopp“ gekennzeichnet sind und umgekehrt. Für unseren Beispielklon wurden folgende Linker verwendet: 5’-Linker: GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG 3’-Linker:TAGGACCCAGCTTTCTTGTAC Fast alle 5’-Linker enthalten die Kozak-Sequenz (CACC) als letzte Nukleotide vor Beginn des Inserts, und einige enthalten zusätzlich zur Kozak-Sequenz auch das ATG selbst (wie der oben genannte). Am anderen Ende des Linkers lässt sich die homologe Sequenz leicht anhand des Endes von attL1 des pENTR221-Backbones (GTACAAAAAAG) identifizieren. Die 3’-Linker sind heterogener, enthalten jedoch alle die Sequenz CTTTCTTG aus attL2. Werden sie zur Herstellung von Klonen mit einem Stoppcodon verwendet, beginnen sie alle mit genau diesem Stoppcodon (TAG, TGA oder TAA). Nun müssen Sie nur noch den offenen Leserahmen aus Ihrer Insertsequenz zwischen die Linkersequenzen kopieren. Falls Ihr 3’-Linker das Start-ATG enthält, müssen Sie dieses überspringen. Kopieren Sie auch nicht das Stoppcodon, da es bei den „Klonen mit Stoppcodon“ immer im Linker enthalten ist und bei den „Klonen ohne Stoppcodon“ nicht vorhanden sein soll. In unserem Beispiel umfasst diese Sequenz die Nukleotide 202–1197 der Zugangsnummer BC012612 . Das wäre:AATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGNun fügen wir den Linker hinzu (erste und letzte Zeile):GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTAGGACCCAGCTTTCTTGTACNun haben wir das erste Problem: Es befindet sich ein Stoppcodon im 3’-Linker (direkt am Anfang der letzten Zeile), obwohl der Klon laut den uns vorliegenden Informationen „ohne Stoppcodon“ sein sollte.Wir haben den Klon sequenziert und festgestellt, dass der einzige Unterschied zwischen den Klonen mit und ohne Stoppcodon eine Mutation ist, die das TAG-Stoppcodon in ein TTG-Codon (Leucin) umwandelt. Daher ersetzen wir ein A-Nukleotid in der obigen Sequenz durch ein T-Nukleotid:GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTTGGACCCAGCTTTCTTGTACDer letzte Schritt besteht darin, diese Sequenz in die leere pENTR221-Sequenz einzufügen, die wir in SnapGene geöffnet haben. Konkret wählt man die 32 Nukleotide von 652 bis 687 aus und ersetzt sie durch die obige Sequenz. Voilà! Leider macht mir die Tatsache, dass die Linker nicht immer korrekt angegeben sind, ein ungutes Gefühl. Nach unserer eigenen Erfahrung enthalten die Bibliotheksreplikate des Orfeoms jedoch so viele Fehler, dass es ohnehin ratsam ist, das gesamte Insert mit T7- oder M13-Rev-Primern vom 3’-Ende und einem M13-Fwd-Primer vom 5’-Ende zu sequenzieren. Auf diese Weise können Sie eventuelle Linkerfehler aufdecken, die bei der Annotation der Klone unterlaufen sind.

SnapGene und partielle Restriktionsverdauungen – ein erneuter Blick darauf

Thu, 23 Aug 2018 00:00:00 +0000

SnapGene ist eine Software für Molekularbiologen im Labor, die viel mit Klonierung zu tun haben (Konstruktdesign und Annotation). Seit meinem letzten Beitrag über die SnapGene-Software ( https://www.snapgene.com/ ) hat sich viel Positives getan:

SnapGene – Einfach die beste Software zur DNA-Bearbeitung

Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 +0000

Unser Labor nutzt verschiedene Softwarepakete zur Planung, Dokumentation und Visualisierung von DNA-Konstrukten. Zu den Programmen, die uns lange Zeit sehr gut gefallen haben, gehörten das GeneConstructionKit (GCK) und Clone Manager (Professional) . Letzteres läuft leider nur unter Windows. Da jedoch mehrere unserer Computer mit Ubuntu Linux betrieben werden, haben wir die GCK-Versionen 2.5 und 3 mithilfe von WINE (eine Kompatibilitätsschicht, die es uns ermöglicht, native Windows-Programme unter Linux auszuführen). Mit dem Upgrade auf Version 4 wurde GCK unter WINE jedoch unbrauchbar langsam, sodass wir nach einem Ersatz suchten. Wir haben die Entwickler von GCK kontaktiert, aber diese waren offenbar weder bereit noch in der Lage, uns zu helfen. Ich vermute, dass der Quellcode von GCK wahrscheinlich mehr als 20 Jahre alt ist und sich aus diesem Grund niemand traut, ihn anzurühren. Genau zu dieser Zeit wurde SnapGene veröffentlicht, das fast alle unsere Anforderungen erfüllte:

2-wöchiger Laborkurs

Tue, 30 Dec 2014 00:00:00 +0000

Ich hatte keine Ahnung, wie viel Arbeit es macht, einen praktischen Laborkurs zu organisieren. Hätte ich das gewusst, hätte Pirjo es viel schwerer gehabt, mich davon zu überzeugen, diesen Kurs für das DPBM-Graduiertenkolleg zu veranstalten. Kari hatte mich gewarnt… Der dazugehörige Vorlesungskurs hatte von September bis November stattgefunden. Der Praktikumskurs war mit 16 freien Plätzen ausgeschrieben worden, doch das war völlig unrealistisch, da wir auf meine 23,7 Quadratmeter Laborfläche beschränkt waren. Es gibt zwar Lehrlaborräume, aber ohne die Ausrüstung und die gesamte sonstige Infrastruktur, die für ein solches Vorhaben erforderlich ist. Acht Personen hatten sich für den Praktikumskurs angemeldet, und – glücklicherweise – sprang die Hälfte davon in letzter Minute ab, da sie sich der hohen Arbeitsbelastung, die der Kurs erforderte, nicht in ausreichendem Maße widmen konnten. So blieben schließlich vier Studierende und drei Projekte übrig. Mit mehr hätten wir es auf keinen Fall geschafft. Die Idee war, jedem Teilnehmer die Möglichkeit zu bieten, sein eigenes Projekt zur DNA-Klonierung und Proteinexpression zu realisieren – etwas, das für sein eigenes Promotionsstudium relevant wäre. Zu diesem Zweck hatte ich einen Monat im Voraus Besprechungen mit den drei Gruppen, um die Klonierung zu planen und die notwendigen Materialien zu bestellen. Wir arbeiteten parallel an den folgenden drei Projekten:

Klonierung on Michael’s Domain

Rekonstruktion der Sequenz eines Entry-Vektors (pENTR221) aus der OCAA-Bibliothek

SnapGene und partielle Restriktionsverdauungen – ein erneuter Blick darauf

SnapGene – Einfach die beste Software zur DNA-Bearbeitung

2-wöchiger Laborkurs