Wie viel PCR-Produkt kann man gewinnen?

Thu, 10 Mar 2016 00:00:00 +0000

Wie viel PCR-Produkt erhält man bei einer typischen PCR-Reaktion? 50–120 ng/µl scheinen ein typisches Ergebnis zu sein, aber das hängt stark von den jeweiligen PCR-Bedingungen ab. Wenn Sie die Primer-Konzentration minimieren müssen, um die Spezifität zu maximieren, können Ihre Ausbeuten deutlich darunter liegen. Umgekehrt gilt: Wenn die Spezifität keine Rolle spielt (z. B. bei einigen PCR-Klonierungen), können Sie ein Vielfaches davon erhalten.Betrachten wir das typische Maximalvolumen einer einzelnen PCR-Reaktion, nämlich 100 µl. Nehmen wir außerdem an, dass keine Spezifitätsprobleme bestehen und wir daher große Mengen an Primern (jeweils 1 µM) und dNTPs (0,2 µM) verwenden können. Da die Synthese jedes Moleküls des doppelsträngigen PCR-Produkts einen Primer verbraucht, entspricht die theoretische maximale molare Konzentration des doppelsträngigen (ds) DNA-Produkts Ihrer Primerkonzentration: 1 µM. 1 µM dsDNA entspräche 100 pmol bei einer 100-µl-PCR-Reaktion. Wie viel ist das in Mikrogramm? Das hängt natürlich von der Länge Ihres PCR-Produkts ab: Beispielsweise entsprechen 100 pmol dsDNA mit einer Länge von 1000 bp 66 µg. Kann man wirklich so viel erhalten? Nicht in unserem Beispiel eines 1000-bp-Produkts. Der Grund dafür ist, dass die Bausteine der DNA, die dNTPs, lange vor den Primern aufgebraucht sind. Bei dem 1000-bp-Produkt sind erst 40 % der Primer verbraucht, wenn die dNTPs aufgebraucht sind (unter der Annahme eines GC-zu-AT-Verhältnisses von 50:50 in Ihrem Amplikon). Um ein Molekül eines 1000-bp-dsPCR-Produkts herzustellen, benötigt man etwa 2000 Moleküle dNTPs. Für unser Beispiel wäre daher ein 400-bp-PCR-Produkt optimal, da sowohl die Primer als auch die dNTPs in gleichem Tempo aufgebraucht werden.Es scheint, dass man die dNTP-Konzentration erhöhen müsste, wenn man größere Mengen längerer PCR-Produkte erhalten möchte. In unserem Beispiel mit einem 1000-bp-Produkt beträgt die theoretische maximale Menge an PCR-Produkt jedoch etwa 26 µg, was enorm ist und für die meisten Anwendungen ausreicht. Es gibt einen Online-Rechner, mit dem Sie mit der Primer- und dNTP-Konzentration sowie der Produktlänge experimentieren können: http://www.bioline.com/us/media/calculator/01_14.html

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