Eine unmögliche Overlap-Extension-PCR

Sat, 21 Jun 2025 00:00:00 +0000

Ein Doktorand von mir fragte mich nach Plasmidkarten für mehrere DNA-Konstrukte, die ich vor etwa 20 Jahren erstellt hatte. Da es SnapGene zu dieser Zeit noch nicht gab, hatte ich das inzwischen veraltete GeneConstructionKit2 verwendet. Ich habe damals viele Klonierungen durchgeführt, aber ich habe nicht für alle systematisch Plasmidkarten erstellt. Das GCK2-Format erlaubte leider keine einfache Annotation. Man benötigte ein separates Programm für eine umfassende Annotation der Plasmide, und diese Daten wurden in einer separaten Datei gespeichert, der sogenannten „Illustrationsdatei“: Was konnte da schon schiefgehen? Gestern habe ich schließlich meine alten Laborbücher herausgesucht und etwa 10 alte Klonierungen in SnapGene nachvollzogen. Ich war jedoch nicht in der Lage, eine der Klonierungen zu simulieren, da SnapGene das Funktionieren eines „suboptimalen“ PCR-Primers blockierte.

Kostengünstiges PCR-basiertes Mutagenese-Kit

Thu, 26 Nov 2020 00:00:00 +0000

Wenn Sie Ihr DNA-Konstrukt modifizieren müssen, ist eine häufig verwendete Methode die PCR-basierte Mutagenese, bei der Sie die Mutation in die Mitte zweier komplementärer Primer einbauen. Alternativ können Sie für längere Insertionen einen Primer-Tag verwenden. Anschließend amplifizieren Sie einfach das gesamte Konstrukt mittels PCR. Dies funktioniert recht gut bei Konstrukten, die kleiner als ~10 kb sind. Zu diesem Zweck sind mehrere kommerzielle Kits erhältlich, die sich in den Details unterscheiden. Dazu gehören das QuickChange-Kit von Agilent und das Q5 SDM-Kit von NEB sowie das Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit von ThermoFisher. Das QuikChange-Kit ist das teuerste (auch weil man es immer zusammen mit kompetenten Zellen kauft) und das NEB-Kit ist eher preisgünstig (168 € für mich hier in Finnland). Die meisten Kits sind für 10 Reaktionen ausgelegt. Aber was macht man, wenn man nur eine oder zwei Mutagenese-Reaktionen durchführen möchte? Kauft man das ganze Kit? Vor zwei Wochen stand ich vor dieser Frage. Ich ging zu unserem Enzym-Gefrierschrank und stellte fest, dass wir T4-DNA-Ligase, Polynukleotidkinase (PNK) und Phusion-Polymerase haben. Das ist alles, was man braucht, um sein eigenes Kit für die ortsspezifische Mutagenese herzustellen!

Mutagenese on Michael’s Domain

Eine unmögliche Overlap-Extension-PCR

Kostengünstiges PCR-basiertes Mutagenese-Kit