PCR on Michael’s Domain

Eine unmögliche Overlap-Extension-PCR

Sat, 21 Jun 2025 00:00:00 +0000

Ein Doktorand von mir fragte mich nach Plasmidkarten für mehrere DNA-Konstrukte, die ich vor etwa 20 Jahren erstellt hatte. Da es SnapGene zu dieser Zeit noch nicht gab, hatte ich das inzwischen veraltete GeneConstructionKit2 verwendet. Ich habe damals viele Klonierungen durchgeführt, aber ich habe nicht für alle systematisch Plasmidkarten erstellt. Das GCK2-Format erlaubte leider keine einfache Annotation. Man benötigte ein separates Programm für eine umfassende Annotation der Plasmide, und diese Daten wurden in einer separaten Datei gespeichert, der sogenannten „Illustrationsdatei“: Was konnte da schon schiefgehen? Gestern habe ich schließlich meine alten Laborbücher herausgesucht und etwa 10 alte Klonierungen in SnapGene nachvollzogen. Ich war jedoch nicht in der Lage, eine der Klonierungen zu simulieren, da SnapGene das Funktionieren eines „suboptimalen“ PCR-Primers blockierte.

Kostengünstiges PCR-basiertes Mutagenese-Kit

Thu, 26 Nov 2020 00:00:00 +0000

Wenn Sie Ihr DNA-Konstrukt modifizieren müssen, ist eine häufig verwendete Methode die PCR-basierte Mutagenese, bei der Sie die Mutation in die Mitte zweier komplementärer Primer einbauen. Alternativ können Sie für längere Insertionen einen Primer-Tag verwenden. Anschließend amplifizieren Sie einfach das gesamte Konstrukt mittels PCR. Dies funktioniert recht gut bei Konstrukten, die kleiner als ~10 kb sind. Zu diesem Zweck sind mehrere kommerzielle Kits erhältlich, die sich in den Details unterscheiden. Dazu gehören das QuickChange-Kit von Agilent und das Q5 SDM-Kit von NEB sowie das Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit von ThermoFisher. Das QuikChange-Kit ist das teuerste (auch weil man es immer zusammen mit kompetenten Zellen kauft) und das NEB-Kit ist eher preisgünstig (168 € für mich hier in Finnland). Die meisten Kits sind für 10 Reaktionen ausgelegt. Aber was macht man, wenn man nur eine oder zwei Mutagenese-Reaktionen durchführen möchte? Kauft man das ganze Kit? Vor zwei Wochen stand ich vor dieser Frage. Ich ging zu unserem Enzym-Gefrierschrank und stellte fest, dass wir T4-DNA-Ligase, Polynukleotidkinase (PNK) und Phusion-Polymerase haben. Das ist alles, was man braucht, um sein eigenes Kit für die ortsspezifische Mutagenese herzustellen!

Kapa HiFi überzeugt, Phusion funktioniert mehr oder weniger, Q5 und Platinum SuperFi enttäuschen

Fri, 02 Dec 2016 00:00:00 +0000

Meine letzte NEBuilder-Assemblierung ist ins Stocken geraten, weil ich zwei der PCR-Reaktionen nicht zum Laufen bringen konnte. Ich benötigte ein kleines Fragment und zwei ~3-kb-Fragmente. Ich musste eine 2A-Sequenz zwischen das kleine und eines der 3-kb-Fragmente einfügen und fügte daher die erforderlichen Sequenzen als Enden an die Primer an. Die Matrize war nicht besonders GC-reich, also nichts allzu Kompliziertes, aber bei meinem ersten Versuch amplifizierte sich nur das kleine Fragment. Als auch mein zweiter Versuch, die 3-kb-Fragmente zu amplifizieren, scheiterte, beschloss ich, einige alternative Polymerasen auszuprobieren. Für Klonierungszwecke habe ich in den letzten Jahren ausschließlich die Phusion High Fidelity DNA-Polymerase (von New England Biolabs oder von ThermoFisher ) verwendet, aber vielleicht gab es ja etwas Besseres und Robusteres? Ich erhielt drei verschiedene kostenlose Proben zum Testen: KAPA HiFi HotStart , NEB Q5® High-Fidelity sowie ThermoFisher Platinum SuperFi™ . Mein Doktorand hat gestern die PCRs durchgeführt, und ich habe heute die Gele gelockt. An der Gelqualität sieht man, dass ich nicht mehr viel Routine habe, aber die Gesamtergebnisse sind recht eindeutig, und in Zukunft wird KAPA unsere erste Wahl bei kniffligen Templates sein. Ich denke, die Korrekturfähigkeiten von KAPA liegen etwas unter denen von Phusion, aber es macht mir nichts aus, wenn 2 % statt 0,5 % der DNA-Produkte eine Mutation enthalten.In der angehängten PDF-Datei ist zu sehen, dass meine Doktorandin zwei weitere Proben für die Phusion-Polymerase hinzugefügt hat, bei denen sie die gleichen Bedingungen, aber eine andere Matrize (supergewickeltes Plasmid statt linearer DNA) verwendet hat. Überraschenderweise hat die Phusion-Polymerase die supergewickelte DNA viel besser amplifiziert als die (gleiche) lineare DNA; ich kann mir das nicht erklären…

Wie viel PCR-Produkt kann man gewinnen?

Thu, 10 Mar 2016 00:00:00 +0000

Wie viel PCR-Produkt erhält man bei einer typischen PCR-Reaktion? 50–120 ng/µl scheinen ein typisches Ergebnis zu sein, aber das hängt stark von den jeweiligen PCR-Bedingungen ab. Wenn Sie die Primer-Konzentration minimieren müssen, um die Spezifität zu maximieren, können Ihre Ausbeuten deutlich darunter liegen. Umgekehrt gilt: Wenn die Spezifität keine Rolle spielt (z. B. bei einigen PCR-Klonierungen), können Sie ein Vielfaches davon erhalten.Betrachten wir das typische Maximalvolumen einer einzelnen PCR-Reaktion, nämlich 100 µl. Nehmen wir außerdem an, dass keine Spezifitätsprobleme bestehen und wir daher große Mengen an Primern (jeweils 1 µM) und dNTPs (0,2 µM) verwenden können. Da die Synthese jedes Moleküls des doppelsträngigen PCR-Produkts einen Primer verbraucht, entspricht die theoretische maximale molare Konzentration des doppelsträngigen (ds) DNA-Produkts Ihrer Primerkonzentration: 1 µM. 1 µM dsDNA entspräche 100 pmol bei einer 100-µl-PCR-Reaktion. Wie viel ist das in Mikrogramm? Das hängt natürlich von der Länge Ihres PCR-Produkts ab: Beispielsweise entsprechen 100 pmol dsDNA mit einer Länge von 1000 bp 66 µg. Kann man wirklich so viel erhalten? Nicht in unserem Beispiel eines 1000-bp-Produkts. Der Grund dafür ist, dass die Bausteine der DNA, die dNTPs, lange vor den Primern aufgebraucht sind. Bei dem 1000-bp-Produkt sind erst 40 % der Primer verbraucht, wenn die dNTPs aufgebraucht sind (unter der Annahme eines GC-zu-AT-Verhältnisses von 50:50 in Ihrem Amplikon). Um ein Molekül eines 1000-bp-dsPCR-Produkts herzustellen, benötigt man etwa 2000 Moleküle dNTPs. Für unser Beispiel wäre daher ein 400-bp-PCR-Produkt optimal, da sowohl die Primer als auch die dNTPs in gleichem Tempo aufgebraucht werden.Es scheint, dass man die dNTP-Konzentration erhöhen müsste, wenn man größere Mengen längerer PCR-Produkte erhalten möchte. In unserem Beispiel mit einem 1000-bp-Produkt beträgt die theoretische maximale Menge an PCR-Produkt jedoch etwa 26 µg, was enorm ist und für die meisten Anwendungen ausreicht. Es gibt einen Online-Rechner, mit dem Sie mit der Primer- und dNTP-Konzentration sowie der Produktlänge experimentieren können: http://www.bioline.com/us/media/calculator/01_14.html

Formel zur Berechnung der Annealing-Temperatur von Oligonukleotiden für die PCR

Wed, 30 Aug 2006 00:00:00 +0000

Die Faustregel zur Berechnung der Annealing-Temperatur für einen PCR-Primer lautet: Tm (°C) = 81,5 + 0,41(%GC) – (675/N), wobei %GC der prozentuale Anteil an G- und C-Nukleotiden im Oligo ist und N die Länge des Oligos in Nukleotiden angibt.