Kapa HiFi überzeugt, Phusion funktioniert mehr oder weniger, Q5 und Platinum SuperFi enttäuschen

Fri, 02 Dec 2016 00:00:00 +0000

Meine letzte NEBuilder-Assemblierung ist ins Stocken geraten, weil ich zwei der PCR-Reaktionen nicht zum Laufen bringen konnte. Ich benötigte ein kleines Fragment und zwei ~3-kb-Fragmente. Ich musste eine 2A-Sequenz zwischen das kleine und eines der 3-kb-Fragmente einfügen und fügte daher die erforderlichen Sequenzen als Enden an die Primer an. Die Matrize war nicht besonders GC-reich, also nichts allzu Kompliziertes, aber bei meinem ersten Versuch amplifizierte sich nur das kleine Fragment. Als auch mein zweiter Versuch, die 3-kb-Fragmente zu amplifizieren, scheiterte, beschloss ich, einige alternative Polymerasen auszuprobieren. Für Klonierungszwecke habe ich in den letzten Jahren ausschließlich die Phusion High Fidelity DNA-Polymerase (von New England Biolabs oder von ThermoFisher ) verwendet, aber vielleicht gab es ja etwas Besseres und Robusteres? Ich erhielt drei verschiedene kostenlose Proben zum Testen: KAPA HiFi HotStart , NEB Q5® High-Fidelity sowie ThermoFisher Platinum SuperFi™ . Mein Doktorand hat gestern die PCRs durchgeführt, und ich habe heute die Gele gelockt. An der Gelqualität sieht man, dass ich nicht mehr viel Routine habe, aber die Gesamtergebnisse sind recht eindeutig, und in Zukunft wird KAPA unsere erste Wahl bei kniffligen Templates sein. Ich denke, die Korrekturfähigkeiten von KAPA liegen etwas unter denen von Phusion, aber es macht mir nichts aus, wenn 2 % statt 0,5 % der DNA-Produkte eine Mutation enthalten.In der angehängten PDF-Datei ist zu sehen, dass meine Doktorandin zwei weitere Proben für die Phusion-Polymerase hinzugefügt hat, bei denen sie die gleichen Bedingungen, aber eine andere Matrize (supergewickeltes Plasmid statt linearer DNA) verwendet hat. Überraschenderweise hat die Phusion-Polymerase die supergewickelte DNA viel besser amplifiziert als die (gleiche) lineare DNA; ich kann mir das nicht erklären…

Platinum SuperFi on Michael’s Domain

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