Proteine on Michael’s Domain

Entdeckung und Entwicklung von Proteinwirkstoffen

Wed, 09 Sep 2020 00:00:00 +0000

Gestern habe ich meine erste Zoom-Vorlesung zum Thema „Entdeckung und Entwicklung von Proteinwirkstoffen“ gehalten. Ich hoffe, dass die Studierenden zumindest etwas davon mitgenommen haben. Mein Ziel ist es, die gesamte Präsentation unter einer CC-Lizenz zu veröffentlichen, aber es gibt noch ein paar Bilder, die ich ersetzen muss. Ein erster Versuch ist selten eine Glanzleistung, und wir hatten auch unseren Anteil an technischen Problemen. Mein Headset hat zum ersten Mal seit dem Kauf zu Beginn der Covid-19-Pandemie den Geist aufgegeben. Und die Zoom-Umfragefunktion verschwand, bevor die Studierenden überhaupt die Gelegenheit hatten, sie zu nutzen, und es gelang uns nicht, sie wieder zum Laufen zu bringen. Hier ist der Link zur Live-Präsentation in Google Slides: https://mjlab.fi/pddd . Diese werden sich weiter ändern (= verbessern). Unten findet ihr den PDF-Schnappschuss der Präsentation vom eigentlichen Vorlesungstag. Die gesamte Präsentation ist CC-lizenziert. Ihr könnt sie also gerne wiederverwenden. Alle Quelldateien (größtenteils im Inkscape-SVG-Format) sind ebenfalls hier verfügbar: https://mjlab.fi/pddd-files . Ich habe alle SVG-Dateien in Inkscape erstellt, aber ihr könnt sie auch in jedem Browser öffnen oder in Adobe Illustrator bearbeiten. Wenn ihr Bilder bearbeiten oder extrahieren möchtet, ist es vielleicht am einfachsten, die Präsentation im Microsoft PowerPoint-, LibreOffice Impress- oder PDF-Format herunterzuladen. Ich habe noch nicht herausgefunden, wie ich die Google-Slides-Präsentation freigeben kann, ohne das Original für alle bearbeitbar zu machen (schließlich brauche ich eine gewisse Kontrolle über den Inhalt meiner Vorlesungen).Beachten Sie bitte, dass die Präsentation derzeit noch acht Bilder enthält, die unter Fair Use stehen oder deren Lizenzbedingungen unbekannt sind (auch wenn das rechtliche Konzept des „Fair Use“ außerhalb der USA eigentlich nicht existiert). Alle Bildquellen (mit Ausnahme meiner eigenen Bilder) sind in der Datei „README.txt“ mit den jeweiligen Lizenzen und Quell-URLs aufgeführt. Einige Bilder sind so alt, dass ich ihre ursprünglichen URLs nicht mehr ausfindig machen konnte. Daher bin ich mir hinsichtlich ihrer Lizenzbedingungen nicht sicher. Ich werde diese in den nächsten Wochen ersetzen, sobald ich CC-lizenzierte oder gemeinfreie Alternativen finden kann.

Aufreinigung und Charakterisierung rekombinanter Proteine

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Wir organisieren (erneut) einen praxisorientierten Kurs zur Proteinreinigung vom 4. bis zum 20. Dezember. Wir können maximal 16 Teilnehmer aufnehmen, die in Gruppen von 2 bis 4 Teilnehmern eingeteilt werden. Jede Gruppe benötigt drei volle Tage, um die praktischen Übungen durchzuführen, wobei sich der dritte Tag des Kurses mit dem ersten Tag der nächsten Gruppe überschneidet. Veranstaltungsort ist das Biomedicum Helsinki, Räume A516a1 (wo sich die Geräte befinden) und B318a/b (unser Labor). Wir werden ein Protein (VEGF-Rezeptor 3) mithilfe eines zweistufigen Protokolls (Affinitätschromatographie + Gelfiltration) auf dem Äkta Avant FPLC-Gerät aufreinigen. Am dritten Kurstag werden wir die Wechselwirkung dieses Proteins mit seinem Liganden (VEGF-C) auf dem ITC-Gerät (isotherme Kalorimetrie) untersuchen. Wir haben bereits 2015 einen ähnlichen Kurs angeboten ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Dieser neue Kurs ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) wird einen ähnlichen Aufbau haben, wir erweitern ihn jedoch um einen Tag, um Protein-Wechselwirkungen mithilfe des neuen Isothermischen-Kalorimetrie-Geräts unserer B3P-Kernanlage zu analysieren. Die Dokumentation und die Ergebnisse werden ebenfalls hier verfügbar sein.Da wir maximal zwei Proben gleichzeitig bearbeiten können (wir verfügen „nur“ über zwei FPLC-Geräte), müssen wir die Teilnehmer in Gruppen (mit jeweils 2–4 Studierenden) aufteilen und den dreitägigen Kurs je nach Teilnehmerzahl mehrmals wiederholen.

FPLC-Kurs zur Proteinreinigung

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Acht Doktoranden hatten sich für den FPLC-Kurs zur Proteinreinigung angemeldet, der im Dezember stattfand. Wenn ich etwas gelernt habe, dann, dass die Proteinreinigung im Rahmen eines Kurses IMMER mit einem Protein und einem Protokoll durchgeführt werden sollte, die bereits VIELE Male erfolgreich angewendet wurden. Von den Studierenden mitgebrachte Proteine sind eine hervorragende Lernquelle, doch die zeitlichen Einschränkungen eines Kursformats erlaubten es uns nicht, die Aufreinigung dieser Proteine noch während des Kurses abzuschließen.Technische Probleme mit dem neuen Äkta Avant 25Zudem war das Äkta Avant 25 , die wir diesen Sommer neu bei GE Healthcare erworben hatten, fiel während des Kurses ZWEIMAL aus. Zunächst fiel der Steuerungscomputer aus (RAID-Ausfall). HP lieferte die Ersatzfestplatte innerhalb von 24 Stunden, und nachdem sich das RAID wiederhergestellt hatte, konnten wir den Kurs fortsetzen. Beim ersten Durchlauf nach diesem Vorfall trat beim Äkta jedoch ein Überdruckproblem auf. Wir identifizierten einen defekten Durchflussbegrenzer als Ursache identifiziert, wollten den Lauf jedoch nicht fortsetzen, da wir bei früheren Durchläufen bereits schwerwiegende Probleme mit Luftblasen hatten. Daher führten wir die Durchläufe auf dem alten Äkta Explorer 100 durch. GE Healthcare ließ das System umgehend von einem Servicetechniker überprüfen, doch da dieser kein Ersatzgerät dabei hatte, mussten wir bis Montag, den 14.12., warten, bis der Äkta Avant wieder voll funktionsfähig war.Was wir aufgereinigt haben: lösliches VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) und HepsinWir haben lösliches humanes VEGF-Rezeptor-3 aufgereinigt (die ersten drei Domänen seiner extrazellulären Domäne, verbunden mit dem konstanten Fc-Teil von humanem IgG). Diese Aufreinigung haben wir bereits mehrfach durchgeführt. Sie entspricht der Aufreinigung von Antikörpern mit Protein-A-Sepharose.Wir hatten im Vorfeld konditioniertes Zellkulturmedium vorbereitet. Wir produzieren die meisten unserer Proteine in Insektenzellen (hauptsächlich Drosophila S2), und das VEGFR-3/Fc war von den S2-Zellen nach Induktion des Metallothionein-Promotors mit 1 mM Cu²⁺ über etwa 4,5 Tage hinweg in das Medium sekretiert worden. Die Vorbereitung des Mediums für die Aufreinigung besteht lediglich aus 1) dem Entfernen der Zellen durch Zentrifugation und 2) der Filtration, um Präzipitate und andere kleine Partikel zu entfernen, die die Säule verstopfen könnten. Eine Anpassung des pH-Werts ist nicht erforderlich.Eine schnelle Neutralisierung nach der Elution bei niedrigem pH-Wert IST WICHTIGWir haben das Medium über eine Einweg-5-ml- HiTrap-Rekombinant-Protein-A-Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von etwa 1 ml/min und eluierten es mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Die eluierten 2-ml-Fraktionen wurden sofort mit 400 µl 1 M Tris (pH 8,5) neutralisiert. Hier unterlief uns bei einer der beiden Aufreinigungen ein kleiner Fehler. GE Healthcare hatte die Kassetten für die 5-ml-Sammelröhrchen noch nicht freigegeben (dies ist bis heute nicht geschehen, obwohl sie bereits für September 2015 versprochen worden waren), und wir verwendeten 15-ml-Falcon-Röhrchen zur Sammlung der 2-ml-Fraktionen, in die wir zuvor 400 µl der Neutralisationslösung alikvotiert hatten. Allerdings war die Durchmischung in diesen Röhrchen nicht effizient, und die längere Einwirkung eines niedrigen pH-Werts führte zu einer teilweisen Schädigung unseres Proteins. Dies lässt sich beim Vergleich der Größenausschluss-Chromatogramme von Gruppe 2 mit denen von Gruppe 4 erkennen: Bei Gruppe 4 ist der erste Peak (aggregiertes Protein) im Vergleich zum entsprechenden Peak bei Gruppe 2 deutlich größer und heterogener. Tatsächlich fällt VEGFR-3/Fc, wenn es bei niedrigem pH-Wert aus Protein-A-Säulen eluiert wird, bei höheren Konzentrationen kurz nach der Elution stets aus, löst sich jedoch bei Neutralisation wieder auf. Dies geschah in den Fraktionen 5.A.3 und 5.A.4 (Gruppe 4) nicht, da sich Eluat und Neutralisationspuffer im 15-ml-Falcon-Röhrchen nicht ausreichend vermischten (wahrscheinlich trug auch die Fraktionsgröße von 2 ml dazu bei; 1 ml wäre besser gewesen). Während des Laufs für Gruppe 2 haben wir die Röhrchen unmittelbar nach Beendigung des Laufs entnommen und dadurch die Puffer vermischt, während der Lauf für Gruppe 4 über Nacht endete und das Eluat bis zum Morgen weitgehend unvermischt blieb.Alternativ hätten wir mit einem hochkonzentrierten chaotropen Salz bei nahezu neutralem pH-Wert eluieren können (was wir beim nächsten Mal tun werden, falls wir einen automatisierten Lauf haben, bei dem die Elution mitten in der Nacht stattfindet). Pierce bietet einen (proprietären) „sanften“ Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 6,6 an. Ich kenne die Zusammensetzung des Pierce-Puffers nicht, aber es handelt sich um eine hochkonzentrierte Lösung eines chaotropen Salzes. 3 M Kalium-/Natriumthiocyanat oder 4 M Magnesiumchlorid in gepufferten Lösungen um pH 7 sind häufig verwendete chaotrope Salze für diesen Zweck. Hepsin Die von den Studierenden bereitgestellten Proteine stellten eine Herausforderung dar. Erstens war ihre Konzentration im Ausgangsmaterial sehr gering. Während wir das Protein deutlich erkennen können, wenn das VEGFR-3/Fc-konditionierte Medium auf einem PAGE-Gel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt wird, ist für das Hepsin kein solches Band sichtbar. Zudem schien ein erheblicher Anteil des Proteins das Histag (nicht mehr) zu enthalten und wird daher im ersten Reinigungsschritt nicht aufgefangen. Der Anteil an Hepsin-H6, der an Ni²⁺-Sepharose bindet, eluiert bereits bei einer Imidazol-Konzentration von 20 mM, was das Waschen der Säule erschwert. Das Hepsin mit dem längeren Histag (H10) übersteht die 20 mM Imidazol-Waschung zwar, weist jedoch ebenfalls niedrige Expressionsniveaus auf. Nachfolgend sind die Chromatogramme der einzelnen Durchläufe sowie die kommentierten Bilder der mit Coomassie gefärbten PAGE-Gele dargestellt. Das detaillierte Protokoll für den Betrieb des Äkta Avant 25 befindet sich noch in Vorbereitung…

Entlacken

Fri, 01 Nov 2013 00:00:00 +0000

Das erneute Blotten von Membranen mit einem anderen Antikörper ist im Labor eine sehr häufige Aufgabe. Es gibt verschiedene Protokolle zum Strippen von Membranen, wobei die klassische Methode die Verwendung von SDS, β-Mercaptoethanol und Erhitzen vorsieht. Früher habe ich es auch so gemacht, aber das ist eine übelriechende Angelegenheit, da β-Mercaptoethanol nach faulen Eiern riecht. Dann fingen plötzlich alle im Labor an, die Re-Blot Plus von Millipore zu verwenden – und ich auch. Bis ich beim Durchlesen des Sicherheitsdatenblatts feststellte, dass sie billige Chemikalien zu einem überhöhten Preis verkaufen. Jetzt stelle ich den Stripping-Puffer selbst her. Meine 10-fache Lösung hat folgende Zusammensetzung:

Rekombinante Proteine

Fri, 20 Jan 2012 00:00:00 +0000

Früher war hier eine dynamisch verlinkte Liste meiner Proteine. Leider musste ich die direkte Verlinkung zu unserem Labor-Datenbank-Server aus Sicherheitsgründen aufgeben. Irgendwann finde ich vielleicht die Zeit, mit einer sicheren Methode den Inhalt userer Labor-Gefrierschränke hier auf meiner Homepage zu publizieren. Bis dahin gibt es bloss eine Liste der Proteine, die ich produziert habe. Wer Fragen hat oder die Proteine für Forschungszwecke braucht, darf sich gerne an mich oder meinen Chef wenden:

Echte Explorer-FPLC-Zentraleinrichtung

Wed, 26 Jan 2011 00:00:00 +0000

Derzeit widme ich einen Großteil meiner Arbeitszeit der Aufreinigung von Proteinen, die die Angiogenese und Lymphangiogenese regulieren. Daher kümmere ich mich um die dafür erforderliche Ausrüstung, die dem Forschungsprogramm für Molekulare Krebsbiologie zur Verfügung steht: das Gerät zur schnellen Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC). Prof. Jorma Keski-Oja erwarb vor etwa 15 Jahren eines der ersten (und 2010 aus dem Programm genommenen) Äkta Explorer-Geräte des schwedischen Herstellers Pharmacia (der 1997 mit Amersham zu Amersham Pharmacia Biotech fusionierte, das wiederum 2004 von GE Healthcare übernommen wurde). Im Jahr 2000 wurden die Geräte vom Haartman-Institut ins Biomedicum Helsinki verlegt. Zwar habe ich in den letzten fünf Jahren die Webseiten für diese Forschungsinfrastruktur gepflegt (einschließlich Online-Reservierung und Datensicherung), doch waren diese nur innerhalb des Netzwerks der Universität Helsinki zugänglich.Nun ist es mir gelungen, Webseiten über die Äkta Explorer FPLC-Kernanlage in die Website der Medizinischen Fakultät . Derzeit erweitern wir unsere Einrichtung um das WAVE-Zellkultursystem in unsere Einrichtung, um große Mengen an Zellen bzw. Zellkulturüberständen (bis zu 25 Liter Bakterien-, Insekten- oder Säugetierzellkulturen) für die Proteinproduktion herstellen zu können.

HBGS-Kurs

Mon, 10 May 2010 00:00:00 +0000

Alle Dokumente zum HBGS -Kurs Tags bei der Proteinexpression, -nachweis und -aufreinigung. Die meisten Dokumente sind sowohl im PDF- als auch im OpenOffice-Format verfügbar. Sie können die Dokumente gerne weiterverwenden. Sie stehen unter der Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 1.0-Lizenz .

Rekombinante Proteine

Fri, 25 Sep 2009 00:00:00 +0000

Eine dynamisch aktualisierte Liste der verfügbaren Proteine befand sich früher an dieser Stelle. Aus Sicherheitsgründen habe ich jedoch die Anbindung an den Datenbankserver unseres Labors deaktiviert.

Lagerung und Handhabung von Proteinen

Wed, 22 Oct 2008 00:00:00 +0000