Proteinreinigung on Michael’s Domain

Proteine besser herstellen als die Profis

Thu, 31 Oct 2024 00:00:00 +0000

Herzlichen Glückwunsch, Laura und Akseli! Euer Artikel in Scientific Reports ( https://doi.org/10.1038/s41598-024-77104-3 ) ist eine fundierte Arbeit, die nicht nur für Herz-Kreislauf-Erkrankungen von Bedeutung ist, sondern auch für unsere Forschung zum Thema Lipödem/Lipoödem (und damit potenziell sogar für das Lymphödem, das in der Vergangenheit im Mittelpunkt unserer Forschung stand). Es gibt erstaunliche Ähnlichkeiten zwischen der koronaren Herzkrankheit und dem Lipödem, da beide als Fettstoffwechselstörungen betrachtet werden können.Und vielen Dank an Khushbu und Betül, die Laura dabei geholfen haben, ein so hochwertiges LCAT-Protein herzustellen und aufzureinigen, das besser funktionierte als die im Handel erhältlichen Proteinpräparate! Vielleicht lag ein Großteil des Erfolgs in den hohen Expressionsraten, die wir im Vergleich zu anderen Systemen erreichen konnten. Zum ersten Mal haben wir HEK293T-Zellen mit einem maßgeschneiderten CHO-Vektor ( pCHOKE-B-LCAT-H6 ) ausprobiert, und es hat überraschend gut funktioniert. pCHOKE-B wurde von Grund auf neu entwickelt, und wir haben mehrere Verbesserungen integriert, die im Laufe der Jahre im Vergleich zu herkömmlichen CHO-Expressionsvektoren erzielt wurden. Der Vektor enthält

Bio-Rad repariert unser NGC

Wed, 20 Sep 2023 00:00:00 +0000

UPDATE (Stand: 21. Dezember 2024)

Wir haben gerade unseren Kurs zur Proteinreinigung (DPDR-305) hinter uns gebracht (siehe auch meine anderen blog posts über Lehre ). Nachdem wir etwa 25 Aufreinigungen mit dem „reparierten“ Bio-Rad NGC durchgeführt haben, muss ich leider feststellen, dass das größte Problem weiterhin besteht: Das FPLC reagiert nicht mehr auf manuell eingegebene Befehle. Auch die zufälligen Verbindungsabbrüche hielten an. Zwar hatte nur eine Studentengruppe Probleme, doch kam es an diesem einen Tag zu mehreren Vorfällen. Damit endet leider unser kurzer Ausflug in das Bio-Rad-Territorium der Proteinreinigung. All dies deutet darauf hin, dass weitere Investitionen in dieses Gerät reine Zeit- und Geldverschwendung wären. Wir haben weder zu viel Zeit noch zu viel Geld. Wenn Bio-Rad aus eigener Initiative etwas unternehmen möchte, bin ich gerne bereit, ihnen alle notwendigen Maßnahmen zu überlassen, um das Gerät in einen nutzbaren Zustand zu versetzen, aber wir werden keine weiteren Schritte aktiv verfolgen. Der beste Weg, Ihr FPLC-Gerät in gutem Zustand zu halten, ist ein Wartungsvertrag. Obwohl wir in den letzten 30 Jahren zweimal Mittel von unserer Universität erhalten haben, um ein FPLC-Gerät der Spitzenklasse anzuschaffen, ist es viel schwieriger, Mittel für einen Wartungsvertrag zu bekommen. Einer der vielen Gründe dafür ist, dass die meisten Förderzeiträume kürzer sind als Wartungsverträge, die nur dann Sinn machen, wenn sie über mehrere Jahre abgeschlossen werden.

Showdown: „Äkta“ von GE Healthcare gegen „NGC“ von Bio-Rad

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Seit 1996 beschäftige ich mich mit der Reinigung von Proteinen. Bis 2015 arbeitete ich mit einem Äkta Explorer, dann haben wir auf den Äkta Avant umgestellt. Im Jahr 2020 zog mein Labor um, und wir erhielten einen Bio-Rad NGC , den wir nun seit zwei Jahren nutzen.Wir hatten viele Probleme mit dem Bio-Rad NGC. Zunächst dachte ich, dass dies beim Systemwechsel vielleicht normal sei. Ich ging davon aus, dass die Probleme nach und nach verschwinden würden. Schließlich hatten wir auch Probleme, als wir vom Explorer auf den Avant umgestiegen sind.Doch selbst nach zwei Jahren und Dutzenden von Aufreinigungsläufen scheinen die Probleme mit dem NGC nicht aufzuhören. Immer wenn wir ein Problem lösen, taucht ein neues, bisher unbekanntes Problem auf. Und im Gegensatz zu GE Healthcare ist der Kundenservice von Bio-Rad nicht einmal annähernd so gut wie der, den wir von GE Healthcare gewohnt sind. Als unsere IT-Abteilung den Äkta nicht mit dem Netzwerk unserer Universität verbinden konnte, schickte GE Healthcare einen Techniker aus ihrem Münchner Team nach Helsinki, um das Problem zu beheben. In Anbetracht der Einarbeitungszeit bot GE Healthcare außerdem einem Mitarbeiter aus unserem Team die kostenlose Teilnahme an einem ihrer Kurse an. Und ihr Support beschränkte sich nicht auf die Garantiezeit! Sie wollten wirklich, dass wir mit ihrem Gerät zufrieden sind. Von Bio-Rad erfahren wir nicht das gleiche Maß an Unterstützung. Es fühlt sich immer so an, als müssten wir sie dazu zwingen, die Probleme zu lösen, die wir mit dem NGC haben, und ihre Reaktionszeit liegt weit unter jeglichen Kundenerwartungen.Dies ist der erste von mehreren Blogbeiträgen zum Thema „Äkta versus NGC“. Ich hoffe, dass ich in den nächsten Monaten die Zeit finden werde, ausführlicher über all unsere Probleme zu berichten.Wir haben 2015 beschlossen, dass wir endlich ein neues FPLC brauchten. Unser Äkta Explorer näherte sich dem Ende seiner Lebensdauer, und wir hatten rund 100.000 Fördermittel erhalten, um das FPLC unserer Zentraleinrichtung zu erneuern. Das Gerät war so teuer, dass wir das offizielle Ausschreibungsverfahren durchlaufen mussten (damals lag die Obergrenze bei 30.000 €, inzwischen wurde sie jedoch auf 60.000 € angehoben). Es gab nur zwei Mitbewerber: den Bio-Rad Discover NGC und den GE Healthcare Äkta Avant. Das Bio-Rad-Gerät war günstiger (82.810 € gegenüber 95.470 €), doch wir entschieden uns für den Kauf des Geräts von GE Healthcare. Ein wichtiger Grund dafür war, dass alle unsere Nutzer bisher den Äkta Explorer und dessen Unicorn-Software verwendet hatten. Ein Wechsel wäre einfach zu störend gewesen und hätte viel Unterstützung und Zeit unsererseits erfordert. Es gab jedoch auch technische Gründe, die uns dazu veranlassten, den Äkta dem NGC vorzuziehen: Vorteile des Äkta Avant

Aktualisierung des GE Äkta Avant auf Windows 10

Tue, 18 Feb 2020 00:00:00 +0000

Das Avant ist das Flaggschiff der Äkta-Produktreihe von GE Healthcare im Bereich der FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, schnelle Protein-Flüssigkeitschromatographie). Wir nutzen es regelmäßig, und es steht allen an der Universität Helsinki zur Verfügung.Unsere Universität hat beschlossen, sich mit Microsoft gut zu stellen und jeglichen Netzwerkverkehr für Windows-7-Computer zu unterbinden. Da unser Äkta (2015 angeschafft) von vielen verschiedenen Forschern genutzt wird, verlassen wir uns auf Microsofts Active Directory, um Benutzer zu authentifizieren und die Gerätenutzung zu verfolgen. Als die Universität Ende Januar den Windows-7-Verkehr tatsächlich sperrte, haben wir den HP-Computer schließlich von Windows 7 auf Windows 10 aktualisiert. Zuvor hatten wir uns mit GE in Verbindung gesetzt, um sicherzustellen, dass das FPLC weiterhin funktioniert. Obwohl die Build-Nummer von Windows 10, die unsere Universität verwendet (Windows 10 Enterprise Version 1809, Build 17763.1039) von keiner der Unicorn-7-Versionen unterstützt wurde, die GE im Laufe der Jahre veröffentlicht hat (siehe diese Software-Kompatibilitätsübersicht, die ich auf der GE-Website nicht mehr finden kann: https://drive.google.com/open?id=1cA33lEqfEr0MIaA8r9TyoQFcxiHWuZsp) , wurde uns versichert, dass die Software weiterhin funktionieren würde. Leider traf dies nicht zu.**In-Place-Upgrade oder Neuinstallation?**Wir haben ein In-Place-Upgrade von Win7 auf Win10 durchgeführt. Das hat mir noch nie gefallen. Selbst bei etwas überlegenen Betriebssystemen wie macOS und Linux verliefen die Upgrades vor Ort nicht immer reibungslos. Ein Neuanfang war immer die sicherere (und auch schnellere) Wahl.VerbindungsproblemeNach dem Upgrade verlor Unicorn 7 während laufender Proteinreinigungsläufe zunehmend die Verbindung zum Äkta Avant. Bei manuellen Läufen konnten wir deutlich erkennen, dass bestimmte Befehle einen Verbindungsabbruch auslösten. Das Äkta-LCD-Display wurde schwarz und das Gerät startete neu. Natürlich vermuteten wir, dass dies eine Folge des Upgrades auf Windows 10 war. Da Unicorn 7.0.2 nicht auf die Kompatibilität mit unserer Windows-10-Version getestet worden war, wollten wir zunächst versuchen, auf eine Unicorn-7-Version zu aktualisieren, die mit unserem Windows-10-Build getestet worden war. Ich hatte bereits im Dezember bei GE um dieses Update gebeten, aber meine Anfrage war ignoriert worden, und da ich zu dieser Zeit viele andere Dinge zu tun hatte, habe ich mich nie wieder mit diesem Problem befasst (im Nachhinein ein großer Fehler).Software-UpdatesWas Chrome und Firefox wöchentlich still im Hintergrund erledigen (ohne dass der Nutzer es bemerkt), erfordert im Fall von GE fast zwei Wochen Vollzeitaufwand seitens des Nutzers. Ein einfacher Download mag bei Bio-Rad funktionieren, doch GE verlangt ein kompliziertes, undurchsichtiges, nicht transparentes, benutzerunfreundliches, sich ständig änderndes und nicht DSGVO-konformes System, das zudem auf Servern gehostet wird, die so langsam sind, dass man sich ständig fragt, ob der Browser-Tab eingefroren ist. Was es auch wert sein mag: Die Webseiten von GE waren trotz mehrerer Neugestaltungen und der digitalen Transformation von GE schon immer so. Der E-Mail-Verlauf zwischen mir und verschiedenen GE-Supportadressen umfasst bis heute 60 E-Mails (beginnend mit meiner ersten Supportanfrage am 2. Dezember 2019). Hinzu kommen noch einige Telefonate (da E-Mails offenbar oft standardmäßig als „nicht dringend“ eingestuft werden).Datenschutzbedenken hinsichtlich des Umgangs von GE mit KundendatenNachdem ich eine Bestellung für den Download aufgegeben, ein Angebot erhalten, die Bestellung bestätigt und eine Bestellbestätigung erhalten hatte, erhielt ich schließlich die „Erlaubnis“, die neueste Version von Unicorn (nämlich 7.5) herunterzuladen. Ich loggte mich in das „eDeliveryPortal“ von GE ein und stellte fest, dass ich die Softwareberechtigungen und Downloads vieler anderer GE-Kunden sehen konnte, aber keine meiner eigenen. Nach einigem Hin und Her tauchte die Version 7.5 schließlich unter meinen Downloads auf. Meine Lizenz fehlt bis heute. Aber warum sollte ich mir die Mühe machen? Ich könnte jede der anderen Lizenzen nutzen (nachdem ich die MAC-Adresse meines Computers gefälscht habe, da die Software offenbar über die MAC-Adresse der Netzwerkkarte des Computers an einen bestimmten Computer gebunden ist). Dies ist eindeutig ein Verstoß gegen die DSGVO , da es absolut keinen Grund gibt, warum meine Daten (Berechtigungs-IDs, MAC-Adressen, Namen, E-Mail-Adressen) anderen Kunden zugänglich sein sollten. Möglicherweise betrachtet GE die Universität Helsinki als einen einzigen Kunden; das wäre ein vorsätzlicher Verstoß gegen die DSGVO.**Suche nach den Systemkonfigurationsdateien (d. h. der Firmware)**Wir hatten die Systemkonfigurationsdateien jedoch nicht aktualisiert, da ich sie auf der GE LifeScience-Website nicht finden konnte. Wir verwendeten Version 3, während Version 3.6 die aktuellste war. Bemerkenswert ist, dass diese Dateien auch die Firmware für die einzelnen Äkta-Komponenten enthalten. Es scheint, als sei dieser Download gut versteckt. Ich benötigte Hilfe von GE, um ihn zu finden. Die GE LifeScience-Website verfügt über eine Suchfunktion, und die Suche findet den Download sogar. Allerdings ist er möglicherweise der letzte Eintrag in einer Liste von fast 1.000 Treffern (10 Treffer pro Seite). Ein Tipp an GE: Google versteht etwas von Suche! Wenn ihr einfach Google eure gesamte Website indexieren lassen würdet, würden Kunden alles über eine Google-Suche finden. Viele Unternehmen nutzen Google für die interne Suche auf ihrer Website. GE scheint jedoch nur seine Produktseiten für Suchmaschinen-Crawler zugänglich zu machen, nicht aber seine Support-Seiten.**Wo sind unsere Lizenzdateien?**Nach der Aktualisierung der Gerätekonfiguration bestand das Problem weiterhin. Nachdem wir einen Systembericht (und anschließend einen zweiten „erweiterten“ Systembericht) gesendet hatten, kam GE zu dem Schluss, dass höchstwahrscheinlich unser In-Place-Upgrade von Win7 auf Win10 schuld sei, da sie einige Unregelmäßigkeiten in der Datei „SystemEventLog.xml“ feststellen konnten. Ich hatte keinen Grund, an dieser Erklärung zu zweifeln, und bat daher unsere IT-Mitarbeiter um eine Neuinstallation von Windows 10. Anschließend installierte ich Unicorn 7.5, musste jedoch feststellen, dass das Problem weiterhin bestand. Nur als Randbemerkung: Wir hatten ein selbstverschuldetes Problem mit unserer Lizenzdatei (.lic). Das Unicorn-Installationsprogramm verlangt die Installation einer Lizenzdatei, die ich im eDelivery-Portal nirgendwo zum Download gefunden habe (wir haben diese Lizenzdateien als E-Mail-Anhänge direkt vom GE-Support erhalten – warum stehen sie nicht zum Download bereit, da sie leicht verloren gehen können?). Wir hätten eine Kopie unserer Lizenzdatei anlegen sollen, bevor wir unseren Computer für die Neuinstallation von Windows 10 gelöscht haben, aber das haben wir versäumt, und ich musste die Lizenzdatei aus einem Systemsicherungs-Backup herausfischen, das ich glücklicherweise 2016 von diesem Rechner erstellt hatte. Und ich suche immer noch nach unseren Lizenzdateien für verschiedene Systemkomponenten (Classic Evaluation und Column Handling), die zum Zeitpunkt der Systemsicherung noch nicht installiert waren.Downgrade auf Windows 7Um sicherzugehen, dass es sich nicht um einen Hardwarefehler handelte, beschlossen wir, das System wieder auf Windows 7 und Unicorn 7.0.2 zurückzusetzen. Das war schwieriger als erwartet, da wir Windows 7 auf Universitätsrechnern nicht mehr installieren können. Glücklicherweise hatten wir noch einen alten, ungenutzten Dell-Desktop, auf dem Windows 7 lief. Unicorn 7 benötigt zwei Netzwerkkarten (eine für die Kommunikation mit der Außenwelt und eine für ein separates 10. Netzwerk zur Kommunikation mit dem Äkta Avant). Wir haben die Netzwerkkarte von unserem Standardrechner in diesen alten Win-7-Rechner eingebaut. Die Installation und der Betrieb von Unicorn erfordern jedoch einen Internetzugang, da die Software „nach Hause telefoniert“. Genau das ist für Windows-7-Rechner an unserer Universität nicht erlaubt. Daher musste ich über mein Smartphone ein privates Netzwerk einrichten, damit Unicorn 7 mit der GE-Zentrale kommunizieren konnte. Schlimmer noch: Ich musste die MAC-Adresse unseres Standardcomputers klonen, da unsere Unicorn-7-Software offenbar über die MAC-Adresse des Computers an einen bestimmten Rechner gebunden ist. Und ein WLAN-Zugang kam nicht in Frage, da die ursprüngliche MAC-Adresse von einer kabelgebundenen Netzwerkkarte stammte. Es ist nicht möglich, MAC-Adressen zwischen kabelgebundenen Netzwerkkarten und USB-WLAN-Adaptern zu klonen, da MAC-Adressen von WLAN-Karten ein festes Präfix haben. Daher musste ich eine komplizierte Konfiguration von meinem Smartphone über einen Computer zu einem (Kabel-)Router und schließlich zum Dell-Computer mit Windows 7 vornehmen.Windows 10 ist nicht schuld – F-Secure ist der ÜbeltäterZu meiner Überraschung stürzte der Äkta Avant immer wieder ab, wenn Unicorn 7 unter Windows 7 Befehle wie „pause“ oder „end“ ausgab. Doch dann wurde mir klar, dass der Avant – anders als unser alter Äkta Explorer – für die Gerätekommunikation normale Netzwerkkarten verwendet und die Win10-Version der Universität Helsinki standardmäßig durch Fernsteuerungs- und Sicherheitssoftware „erweitert“ ist. Ich ging zur Systemsteuerung und deinstallierte alle Software-Erweiterungen, die von der Universität installiert worden waren. Insbesondere F-Secure Client Security Premium gehörte zu den Programmen, die ich deinstalliert habe. Nach einem Neustart konnte ich den Äkta Avant nicht mehr zum Absturz bringen. Um diesen Befund zu bestätigen, steckte ich die Netzwerkkarte wieder in unseren ursprünglichen Standardcomputer, startete den Rechner neu und blieb beim BitLocker -Bildschirm von Windows hängen. Eine Änderung der Hardwarekonfiguration führt unweigerlich dazu, dass Windows den Startvorgang verweigert. Das hat mich zwar etwas aufgehalten, da ich die IT-Abteilung unserer Universität hinzuziehen musste, die chronisch überlastet und schwer zu erreichen ist. Ich habe die Firewall von F-Secure Client Security Premium gezielt deaktiviert, woraufhin die Abstürze auch unter Windows 10 sofort aufhörten. Es ist sehr schwer zu begründen, warum unsere Universität Produkte von F-Secure benötigen sollte. Windows selbst verfügt (seit XP SP2) über eine sehr leistungsfähige Firewall und hat zudem eine eigene Antivirensoftware ( Windows Security Essentials / Windows Defender ), die mindestens genauso gut ist wie ihre besten Konkurrenten – ganz abgesehen davon, dass sie kostenlos und vollständig in Windows integriert ist (und es nicht erforderlich macht, Hooks von Drittanbietern tief in das Betriebssystem einzubinden).Windows 10 läuft auf unserer Hardware aus dem Jahr 2015 zu langsamEs bleibt uns nur noch, unseren Standardcomputer auf neuere Hardware aufzurüsten. Unsere Fakultät hatte ältere Win7-Computer im Jahr 2019 durch neue Geräte ersetzt, doch dieser Computer war einen Tag zu neu, um in die Aufrüstung einbezogen zu werden. Er ist jedoch bereits fünf Jahre alt und läuft insbesondere nach dem Windows-10-Upgrade sehr langsam. Wenn Ihr Protein während der Aufreinigung eluiert, möchten Sie nicht, dass die Fraktionssammlung erst nach einigen Sekunden beginnt, sondern dass sie sofort startet.

Kurs zur Proteinreinigung 2019

Wed, 31 Jul 2019 00:00:00 +0000

Auch in diesem Dezember veranstalten wir wieder den DPBM-Kurs zur Proteinreinigung in unserem Labor. Sichern Sie sich Ihren Platz, denn dieser praxisorientierte Kurs ist sehr beliebt und es gibt nur 16 Plätze. Sie können Ihr eigenes Protein mitbringen, und wir passen das Kursprogramm individuell an Ihre Bedürfnisse an!Weitere Informationen: http://research.med.helsinki.fi/corefacilities/b3p/teaching.htmlRegistration : https://courses.helsinki.fi/en/dpbm-135/131042336

Die Benutzertrennung in Unicorn 7 erfordert manuelle Eingriffe in einer Netzwerkbenutzerumgebung

Mon, 09 May 2016 00:00:00 +0000

Da wir unseren Äkta Avant in einer Mehrbenutzerumgebung betreiben, müssen wir die Methoden und Ergebnisse der verschiedenen Benutzer voneinander trennen. Standardmäßig kann derzeit jeder Netzwerkbenutzer alle Methoden und Ergebnisse einsehen, die von einem anderen Netzwerkbenutzer auf dem Gerät erstellt wurden. Dies stellt ein erhebliches Datenschutz- und Sicherheitsrisiko dar, da ein böswilliger Benutzer Methoden und Ergebnisse löschen (oder schlimmer noch: verändern) könnte.Unser Äkta ist so eingerichtet, dass sich Benutzer mit ihrem Universitäts-Login und -Passwort über den regulären Windows-Netzwerkauthentifizierungsmechanismus am Unicorn-7-Computer anmelden können. Wenn sich jedoch mehrere Personen die Verantwortung für einen Lauf teilen, ist diese Konfiguration nicht mehr möglich, da sie sich gegenseitig ihre Passwörter mitteilen müssten. Daher haben wir ein lokales Konto eingerichtet, das von Benutzern genutzt werden kann, die sich die Bedienung des Äkta-Geräts teilen möchten. Nach der Anmeldung bei Windows müssen sich die Benutzer noch bei der Unicorn-7-Software anmelden, was sie mit ihrem Hochschul-Benutzernamen und -Passwort tun („Windows-Authentifizierung“). Bei dieser Konfiguration kann jeder Benutzer alle Methoden und Ergebnisse einsehen, was nicht akzeptabel ist. Beim Einrichten eines neuen Benutzers in Unicorn (unter „Zugriff > Ordner“) konnte genau festgelegt werden, auf welche Ordner dieser Benutzer Zugriff hatte, und der Benutzer sah nur seine eigenen Methoden und Ergebnisse. Da die Ordnerstruktur unter Unicorn 5 der Ordnerstruktur des Windows-Dateisystems entsprach, konnten Benutzer Methoden und Ergebnisse jederzeit von einem Ordner in einen anderen kopieren und sie so trotz der vom Unicorn-5-Programm festgelegten Einschränkungen verfügbar machen.Als ich zum ersten Mal las, dass Unicorn 7 die Windows-Netzwerkauthentifizierung unterstützt, hatte ich gehofft, dass wir die mühsame Benutzereinrichtung vermeiden könnten, die wir für jeden Benutzer auf dem Äkta Explorer durchführen mussten. Doch die Mühen gehen weiter, da die einmalige Einrichtung der Benutzerrechte für eine Gruppe uns keine Benutzerisolierung bietet.Erstens kann man in Unicorn 7 nicht den Zugriff einzelner Benutzer einschränken, sondern nur den Zugriff von Gruppen. Wir mussten für jeden Netzwerkbenutzer eine Zugriffsgruppe anlegen, den Netzwerkbenutzer dieser Gruppe hinzufügen, einen separaten Home-Ordner für die Gruppe erstellen und dann den Ordnerzugriff auf diesen Home-Ordner beschränken. Für eine Handvoll Benutzer waren Hunderte von Klicks erforderlich, da standardmäßig kein Zugriff auf irgendetwas besteht und jedes einzelne Kontrollkästchen für Berechtigungen – mit Ausnahme der Administratorrechte – aktiviert werden muss. In dieser Hinsicht ist Windows (und jedes andere Betriebssystem) weitaus intelligenter als Unicorn. Wenn sich ein Universitätsmitarbeiter an einem Rechner anmeldet, an dem er sich zuvor noch nie angemeldet hat, erstellt das System automatisch die gesamte erforderliche lokale Standardordnerstruktur und bindet den privaten Home-Ordner dieses Benutzers ein, ohne Zugriff auf alles zu gewähren, was andere Mitarbeiter auf diesem bestimmten Rechner bisher getan haben. Ich denke, das sollte auch bei Unicorn eine Option sein. Vielleicht gibt es diese Option ja und ich finde sie nur nicht? Ein weiterer großer Nachteil der oben beschriebenen Methode, jeden Benutzer in eine eigene Zugriffsgruppe zu ordnen, ist, dass die Anmeldung bei Unicorn zu einer echten Tortur wird: Zusätzlich zur Eingabe von Benutzername und Passwort muss der Benutzer die richtige Zugriffsgruppe auswählen, damit die Anmeldung erfolgreich ist. Und noch schlimmer: In unserer Konfiguration lässt es sich nicht vermeiden, dass jeder Universitätsmitarbeiter zwei Zugriffsgruppen angehört: einer manuell angelegten Zugriffsgruppe für jeden Benutzer zur Benutzertrennung und der „Standardgruppe“, die über die Windows-Netzwerkauthentifizierung funktioniert – vielleicht Kerberos? Wenn Benutzer also die Standardzugriffsgruppe wählen (die in unserem Fall „Users“ heißt), können sie sich zwar anmelden, sehen aber ihre Methoden und Ergebnisse nicht.Es gibt zwei Gründe, warum wir die Zugriffsgruppe „Users“ nicht löschen können: Zum einen ist dies eine Vorgabe der Fakultät, und zum anderen (und das haben wir versucht) können wir sie nicht mehr löschen, da bereits viele Personen Methoden angelegt und Ergebnisse generiert haben, während sie der Zugriffsgruppe „Users“ angehörten. Daher verhindert UNICORN, dass wir dieses Konto löschen können. Ich arbeite an diesem Problem: Ich sollte direkt auf die zugrunde liegende MS-SQL-Datenbank zugreifen können, um die Eigentumsrechte an den Methoden und Ergebnissen zu ändern. Allerdings war GE nicht gerade auskunftsfreudig, als ich nach der Handhabung von Zugriffsrechten fragte. Die Antwort lautete: Die Zugangsdaten für die Datenbank in einer eigenständigen UNICORN-Lösung sind verschlüsselt und nicht öffentlich zugänglich. Wenn Sie eine Enterprise-Lösung hätten (mit einer eigenen (SQL-Server-)Datenbank), hätten Sie die Kontrolle über die Zugangsdaten und könnten theoretisch die gewünschten Informationen extrahieren (das Format müssen Sie selbst herausfinden; es wird von uns nicht unterstützt). Sie können Ihre Lösung auf eine Enterprise-Version upgraden, wenn Sie möchten. Das klingt schlimmer, als es ist, da wir physischen Zugriff auf den MS-SQL-Server haben und das Extrahieren der Zugangsdaten nicht besonders schwierig zu sein scheint. Aber es kostet mich Zeit, die Schwachstelle zu finden, um „in unser eigenes System einzudringen“, und genau das ärgert mich. Laut Lisa Bromark von GE scheint das Update 7.0.2 dieses Problem jedoch zu beheben: UNICORN kann so konfiguriert werden, dass ein neues Datenbankpasswort verwendet wird. Es ist möglich, ein verschlüsseltes Passwort zu generieren oder ein bereits verschlüsseltes Passwort einzugeben. Dies geschieht durch Ausführen des UNICORN Service Tools nach der Installation von UNICORN.Allerdings ist es unglaublich schwierig, das Update zu bekommen (zumindest scheint es Wochen zu dauern). Die Verteilung erfolgt offenbar immer noch über optische Datenträger und per Post. Ich glaube, das letzte Mal, dass ich mir Software auf einer CD/DVD besorgt habe, ist mehr als 10 Jahre her. GE teilte mir jedoch mit, dass sie gerade dabei sind, die UNICORN-Software-Updates auf „elektronischen Vertrieb“ umzustellen. Willkommen im 21. Jahrhundert!

Die Funktionsweise des Äkta Avant-Fraktionssammlers

Mon, 02 May 2016 00:00:00 +0000

Nachdem wir alle Anlaufschwierigkeiten mit unserem Äkta Avant behoben haben, trauen wir uns endlich, ihn unseren Kunden zur Nutzung zu überlassen. Unsere Kunden sind sehr heterogen und reichen von absoluten Neulingen im Bereich FPLC bis hin zu erfahrenen Äkta-Explorer-Anwendern (und allem, was dazwischen liegt). Wenn wir GE Feedback gegeben haben, war unsere Perspektive natürlich auf einen bestimmten Nutzertyp ausgerichtet. Die Betreuung unserer Kunden eröffnet uns nun jedoch eine neue Perspektive, da wir mit den Usability-Problemen konfrontiert werden, die sie nicht selbst lösen können. An dieser Stelle möchte ich nur einen Stolperstein erwähnen, der uns immer wieder aufgefallen ist: die Logik hinter der Funktionsweise des Fraktionssammlers. Anders als bei den älteren Systemen lässt sich der Fraktionssammler nicht manuell auf die „erste Position“ oder eine beliebig definierte Position zurücksetzen, wie es beispielsweise unter Unicorn 5 möglich war.Wir selbst haben eine ganze Weile gebraucht, um uns an die interne Logik des Fraktionssammelprozesses zu gewöhnen, und benötigten dabei Unterstützung von GE. Dass sich das System nicht intuitiv verhält, wird durch die Tatsache unterstrichen, dass einige der Antworten, die wir von GE-Experten erhielten, unvollständig waren (was für uns zu einigen unangenehmen Probenverlusten führte). Schließlich erhielten wir vom GE-Support eine Tabelle, die das Verhalten des Fraktionssammlers beschreibt (siehe unten). Allerdings ist auch diese Tabelle unvollständig, und wir haben einige Zeilen hinzugefügt, die bestimmte nicht standardmäßige Situationen beschreiben, für die die Tabelle keine Antwort bietet. Diese Änderungen und Ergänzungen zur Beschreibung von GE sind rot markiert.

Leistung der HiLoad 26/60 Superdex PG-Gelfiltrationschromatographie-Säule

Mon, 11 Apr 2016 00:00:00 +0000

Die von uns am häufigsten verwendete Technik zur Proteinreinigung ist die Gelfiltration (auch als Größenausschlusschromatographie bezeichnet). Bei der Gelfiltration werden Proteine nach ihrer Größe getrennt (genauer gesagt nach ihrem „Stokes-Radius“, der weitgehend von ihrer Größe und Form bestimmt wird). Für die Gelfiltration großer Proteinmengen haben wir vor etwa 9 Jahren die HiLoad 26/60 Superdex 200 Prep Grade von GE Healthcare erworben (das Modell 26/60 wurde inzwischen durch das HiLoad 26/600 ersetzt, beide sind jedoch nahezu identisch). Mit dieser Säule lassen sich zwei Proteine, deren Größenunterschied 100 % beträgt, sehr sauber trennen. Daher eignet sie sich zur Trennung von monomeren und dimeren Formen desselben Proteins. Das „Verfallsdatum“ der Säule war März 2012. Nach unserer Erfahrung kann eine solche Säule bei sachgemäßer Handhabung problemlos eine Lebensdauer von 10 bis 15 Jahren erreichen (wir verwenden sie nicht sehr oft, lagern sie in 20 %igem Ethanol und bewahren sie bei +4 °C auf, wenn wir sie über längere Zeit nicht benötigen).

Testbericht zum Äkta Avant 25 von GE Healthcare

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Vor etwa einem Jahr haben wir im Rahmen einer internen Ausschreibung der Fakultät Fördermittel erhalten, um das alte Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC-Gerät der Zentrale Einrichtung für Proteinproduktion und -reinigung zu ersetzen. Der Äkta Explorer war 1996(?) angeschafft worden, als die schwedische Marke Pharmacia noch existierte. Im Jahr 2014 trat das Worst-Case-Szenario ein: Sowohl der Monochromator als auch Xenon-Blitzlampe fast gleichzeitig ausfielen, was uns eine Rechnung von fast 10.000 € bescherte. Daher wollten wir das Gerät durch ein modernes Modell ersetzen. Es gibt nur zwei Unternehmen, die in diesem Bereich seriöse Geräte anbieten, nämlich GE Healthcare ( Äkta-Produktreihe ) und BioRad ( NGC-Produktreihe ). GE Healthcare hat die Marke Äkta im Zuge mehrerer Fusionen von Pharmacia übernommen, während BioRad mit seinen NGC-Modellen, die erst vor wenigen Jahren auf den Markt kamen, ein relativ neuer Wettbewerber ist.Wir haben uns für das Äkta Avant 25 entschieden. Wir wollten auf jeden Fall einen gekapselten, gekühlten Fraktionssammler haben. Außerdem war uns eine vertraute Benutzererfahrung wichtig. Wir führen häufig automatisierte Aufreinigungen durch und möchten nicht, dass unsere Proteine längere Zeit bei Raumtemperatur in offenen Röhrchen stehen, in die Bakterien und Staub aus der Luft eindringen können. Mittlerweile setzen wir den Äkta Avant seit etwa einem halben Jahr ein und haben inzwischen einen guten Eindruck davon, wie er im Vergleich zum Äkta Explorer abschneidet. Obwohl der Avant moderner ist als der Explorer, nutzen alle Anwender unserer Zentraleinrichtung nach wie vor den Explorer. Sie sind mit der Benutzeroberfläche von Unicorn 5.11 vertraut und haben offenbar kein Interesse daran, sich in die – zugegebenermaßen – kompliziertere Benutzeroberfläche des Avant einzuarbeiten. Ein weiterer Grund dafür, dass das Gerät bisher nur intern genutzt wurde, war jedoch die beträchtliche Anzahl an Problemen, auf die wir gestoßen sind. Bei unserem alten Äkta Explorer haben wir noch nie so viele Probleme in so kurzer Folge erlebt. Ich weiß nicht, ob unsere Situation typisch ist (laut den Vertretern von GE Healthcare ist dies nicht der Fall). Dennoch sind hier die Probleme aufgeführt, auf die wir gestoßen sind:

FPLC-Kurs zur Proteinreinigung

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Acht Doktoranden hatten sich für den FPLC-Kurs zur Proteinreinigung angemeldet, der im Dezember stattfand. Wenn ich etwas gelernt habe, dann, dass die Proteinreinigung im Rahmen eines Kurses IMMER mit einem Protein und einem Protokoll durchgeführt werden sollte, die bereits VIELE Male erfolgreich angewendet wurden. Von den Studierenden mitgebrachte Proteine sind eine hervorragende Lernquelle, doch die zeitlichen Einschränkungen eines Kursformats erlaubten es uns nicht, die Aufreinigung dieser Proteine noch während des Kurses abzuschließen.Technische Probleme mit dem neuen Äkta Avant 25Zudem war das Äkta Avant 25 , die wir diesen Sommer neu bei GE Healthcare erworben hatten, fiel während des Kurses ZWEIMAL aus. Zunächst fiel der Steuerungscomputer aus (RAID-Ausfall). HP lieferte die Ersatzfestplatte innerhalb von 24 Stunden, und nachdem sich das RAID wiederhergestellt hatte, konnten wir den Kurs fortsetzen. Beim ersten Durchlauf nach diesem Vorfall trat beim Äkta jedoch ein Überdruckproblem auf. Wir identifizierten einen defekten Durchflussbegrenzer als Ursache identifiziert, wollten den Lauf jedoch nicht fortsetzen, da wir bei früheren Durchläufen bereits schwerwiegende Probleme mit Luftblasen hatten. Daher führten wir die Durchläufe auf dem alten Äkta Explorer 100 durch. GE Healthcare ließ das System umgehend von einem Servicetechniker überprüfen, doch da dieser kein Ersatzgerät dabei hatte, mussten wir bis Montag, den 14.12., warten, bis der Äkta Avant wieder voll funktionsfähig war.Was wir aufgereinigt haben: lösliches VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) und HepsinWir haben lösliches humanes VEGF-Rezeptor-3 aufgereinigt (die ersten drei Domänen seiner extrazellulären Domäne, verbunden mit dem konstanten Fc-Teil von humanem IgG). Diese Aufreinigung haben wir bereits mehrfach durchgeführt. Sie entspricht der Aufreinigung von Antikörpern mit Protein-A-Sepharose.Wir hatten im Vorfeld konditioniertes Zellkulturmedium vorbereitet. Wir produzieren die meisten unserer Proteine in Insektenzellen (hauptsächlich Drosophila S2), und das VEGFR-3/Fc war von den S2-Zellen nach Induktion des Metallothionein-Promotors mit 1 mM Cu²⁺ über etwa 4,5 Tage hinweg in das Medium sekretiert worden. Die Vorbereitung des Mediums für die Aufreinigung besteht lediglich aus 1) dem Entfernen der Zellen durch Zentrifugation und 2) der Filtration, um Präzipitate und andere kleine Partikel zu entfernen, die die Säule verstopfen könnten. Eine Anpassung des pH-Werts ist nicht erforderlich.Eine schnelle Neutralisierung nach der Elution bei niedrigem pH-Wert IST WICHTIGWir haben das Medium über eine Einweg-5-ml- HiTrap-Rekombinant-Protein-A-Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von etwa 1 ml/min und eluierten es mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert. Die eluierten 2-ml-Fraktionen wurden sofort mit 400 µl 1 M Tris (pH 8,5) neutralisiert. Hier unterlief uns bei einer der beiden Aufreinigungen ein kleiner Fehler. GE Healthcare hatte die Kassetten für die 5-ml-Sammelröhrchen noch nicht freigegeben (dies ist bis heute nicht geschehen, obwohl sie bereits für September 2015 versprochen worden waren), und wir verwendeten 15-ml-Falcon-Röhrchen zur Sammlung der 2-ml-Fraktionen, in die wir zuvor 400 µl der Neutralisationslösung alikvotiert hatten. Allerdings war die Durchmischung in diesen Röhrchen nicht effizient, und die längere Einwirkung eines niedrigen pH-Werts führte zu einer teilweisen Schädigung unseres Proteins. Dies lässt sich beim Vergleich der Größenausschluss-Chromatogramme von Gruppe 2 mit denen von Gruppe 4 erkennen: Bei Gruppe 4 ist der erste Peak (aggregiertes Protein) im Vergleich zum entsprechenden Peak bei Gruppe 2 deutlich größer und heterogener. Tatsächlich fällt VEGFR-3/Fc, wenn es bei niedrigem pH-Wert aus Protein-A-Säulen eluiert wird, bei höheren Konzentrationen kurz nach der Elution stets aus, löst sich jedoch bei Neutralisation wieder auf. Dies geschah in den Fraktionen 5.A.3 und 5.A.4 (Gruppe 4) nicht, da sich Eluat und Neutralisationspuffer im 15-ml-Falcon-Röhrchen nicht ausreichend vermischten (wahrscheinlich trug auch die Fraktionsgröße von 2 ml dazu bei; 1 ml wäre besser gewesen). Während des Laufs für Gruppe 2 haben wir die Röhrchen unmittelbar nach Beendigung des Laufs entnommen und dadurch die Puffer vermischt, während der Lauf für Gruppe 4 über Nacht endete und das Eluat bis zum Morgen weitgehend unvermischt blieb.Alternativ hätten wir mit einem hochkonzentrierten chaotropen Salz bei nahezu neutralem pH-Wert eluieren können (was wir beim nächsten Mal tun werden, falls wir einen automatisierten Lauf haben, bei dem die Elution mitten in der Nacht stattfindet). Pierce bietet einen (proprietären) „sanften“ Elutionspuffer mit einem pH-Wert von 6,6 an. Ich kenne die Zusammensetzung des Pierce-Puffers nicht, aber es handelt sich um eine hochkonzentrierte Lösung eines chaotropen Salzes. 3 M Kalium-/Natriumthiocyanat oder 4 M Magnesiumchlorid in gepufferten Lösungen um pH 7 sind häufig verwendete chaotrope Salze für diesen Zweck. Hepsin Die von den Studierenden bereitgestellten Proteine stellten eine Herausforderung dar. Erstens war ihre Konzentration im Ausgangsmaterial sehr gering. Während wir das Protein deutlich erkennen können, wenn das VEGFR-3/Fc-konditionierte Medium auf einem PAGE-Gel aufgetragen und mit Coomassie gefärbt wird, ist für das Hepsin kein solches Band sichtbar. Zudem schien ein erheblicher Anteil des Proteins das Histag (nicht mehr) zu enthalten und wird daher im ersten Reinigungsschritt nicht aufgefangen. Der Anteil an Hepsin-H6, der an Ni²⁺-Sepharose bindet, eluiert bereits bei einer Imidazol-Konzentration von 20 mM, was das Waschen der Säule erschwert. Das Hepsin mit dem längeren Histag (H10) übersteht die 20 mM Imidazol-Waschung zwar, weist jedoch ebenfalls niedrige Expressionsniveaus auf. Nachfolgend sind die Chromatogramme der einzelnen Durchläufe sowie die kommentierten Bilder der mit Coomassie gefärbten PAGE-Gele dargestellt. Das detaillierte Protokoll für den Betrieb des Äkta Avant 25 befindet sich noch in Vorbereitung…

SnapGene – Einfach die beste Software zur DNA-Bearbeitung

Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 +0000

Unser Labor nutzt verschiedene Softwarepakete zur Planung, Dokumentation und Visualisierung von DNA-Konstrukten. Zu den Programmen, die uns lange Zeit sehr gut gefallen haben, gehörten das GeneConstructionKit (GCK) und Clone Manager (Professional) . Letzteres läuft leider nur unter Windows. Da jedoch mehrere unserer Computer mit Ubuntu Linux betrieben werden, haben wir die GCK-Versionen 2.5 und 3 mithilfe von WINE (eine Kompatibilitätsschicht, die es uns ermöglicht, native Windows-Programme unter Linux auszuführen). Mit dem Upgrade auf Version 4 wurde GCK unter WINE jedoch unbrauchbar langsam, sodass wir nach einem Ersatz suchten. Wir haben die Entwickler von GCK kontaktiert, aber diese waren offenbar weder bereit noch in der Lage, uns zu helfen. Ich vermute, dass der Quellcode von GCK wahrscheinlich mehr als 20 Jahre alt ist und sich aus diesem Grund niemand traut, ihn anzurühren. Genau zu dieser Zeit wurde SnapGene veröffentlicht, das fast alle unsere Anforderungen erfüllte:

Neon-Elektroporationsgerät versagt

Tue, 04 Aug 2015 00:00:00 +0000

UPDATE: Wir sind nicht die Einzigen, die versuchen, ihre Betriebskosten zu senken. Dieses Labor hat seine Experimente mit dem Neon-System in Analytic Biochemistry veröffentlicht. Vielen Dank an Joachim Goedhart ( @joachimgoedhart ) für den Hinweis! Das Neon-Transfektionsgerät von Life Technologies (ups, heute Thermo Fischer und früher Invitrogen ) wurde vor etwa fünf Jahren auf den Markt gebracht. Es ist für die einfache Elektroporation von Säugetierzellen konzipiert. Wir verfügen seit 2011 über das Gerät, aber es wurde kaum genutzt. Ich weiß nicht, ob die geringe Akzeptanz an der Benutzerunfreundlichkeit liegt (ich weiß immer noch nicht, wie man die Elektrodenspitze an die Pipette ansetzt, obwohl ich das schon hunderte Male gemacht habe – es ist einfach eine sehr knifflige Mechanik), an den hohen Betriebskosten (für die vergoldeten Einwegelektroden und den proprietären Transfektionspuffer) oder an etwas anderem, das ich nicht herausfinden kann. Es gibt jedoch ein paar Dinge, die ich gerne teilen möchte, da wirklich nützliche Informationen über das Neon-Gerät im Internet rar sind.Das erste Problem, mit dem wir ständig zu kämpfen hatten, waren Luftblasen in der Elektrodenspitze, die zu katastrophal niedrigen Elektroporationseffizienzen führen. Die einzige Möglichkeit, dies wirklich zu verhindern, besteht darin, mindestens 25 % mehr Zellsuspension vorzubereiten, als tatsächlich benötigt wird. Wenn man nur 10 % mehr ansetzt, kommt es bei der letzten Elektroporation aufgrund unvermeidbarer Luftblasen mit Sicherheit zu Lichtbogenbildung (außerdem haftet die Zellsuspension leicht an der Außenseite der Pipettenspitze, was ebenfalls dazu beiträgt, dass man mehr ansetzen muss, als tatsächlich benötigt wird). Infolgedessen ging uns der Elektroporationspuffer R lange vor den Pipettenspitzen aus. Zudem kann man Puffer R nicht separat erwerben. Der Vertreter von Life Technologies, mit dem ich korrespondierte, versprach uns aus Kulanz eine kleine Lieferung Pipettenspitzen und Puffer zu schicken (das war im Januar), aber wir warten immer noch darauf, dass diese eintrifft…Leider ist kürzlich unser altes Elektroporationsgerät Gene Pulser II kaputt gegangen. Bio-Rad repariert es nicht mehr und liefert auch keine Ersatzteile mehr. Es wurde hauptsächlich für die Elektroporation von E. coli verwendet. Ich wusste, dass das Neon-Gerät nicht für die Elektroporation von E. coli ausgelegt ist. Warum nicht und warum kann es nicht für diesen Zweck verwendet werden? Es stellt sich heraus, dass die elektrische Feldstärke für E. coli bei weitem nicht ausreicht (beim BioRad Gene Pulser II wird bei einer typischen bakteriellen Elektroporation ein elektrisches Feld von 12,5 kV/cm erreicht, während das Neon-Gerät gerade einmal etwa 850 V/cm erreicht). Allerdings (so dachte ich), kann das Neon viel längere Impulse erzeugen als der Gene Pulser II (das Neon wird damit beworben, Impulse von bis zu 100 ms liefern zu können, während die typische Impulslänge des Gene Pulser II bei etwa 5 ms liegt). Darüber hinaus kann das Neon automatisch mehrere Impulse abgeben. Deshalb wollte ich testen, ob ein langer und/oder wiederholter Impuls mit geringerer Feldstärke E. coli transformieren kann. Es stellte sich jedoch heraus, dass das Gerät, wenn man Wasser (oder 10 % Glycerin) als Transfektionspuffer für E. coli verwendet (was üblicherweise der Fall ist), meldet, dass die Spitzenelektrode keinen Kontakt herstellt. Dies liegt daran, dass das Gerät durch das Senden eines kleinen Stroms durch das System prüft, ob die Spitze korrekt eingesetzt wurde, und dieser Strom nicht fließt, wenn man E. coli in Wasser resuspendiert hat. Damit das Gerät eine eingesetzte Pipettenspitze als Elektrode „akzeptiert“, benötigt man eine NaCl-Konzentration zwischen 10 und 20 mM. Daher habe ich 15 mM Natriumchlorid als E. coli-Elektroporationspuffer verwendet und die Elektroporationsparameter auf 2500 V und 100 ms eingestellt. Überraschung: Das Gerät weigert sich, einen solchen Impuls abzugeben, da es „Over power limit!“ anzeigt. Die maximale Impulsdauer, die es bei 2500 V liefern kann, beträgt 19 ms. Leider kann selbst dieser Impuls nicht automatisch mehrfach abgegeben werden (wieder: „Over power limit!“). Daher habe ich diesen Impuls manuell zwischen 1 und 20 Mal ausgelöst, aber kein einziges Bakterium hat DNA aufgenommen, und alle Bakterienplatten blieben leer. In der Bedienungsanleitung heißt es: „Das Neon™-Gerät ist so ausgelegt, dass nur bestimmte Werte eingegeben werden können; die Grenzwerte für jeden Wert sind unten aufgeführt. Wenn Ihr Eingabewert den Maximalwert überschreitet, wird eine Fehlermeldung angezeigt. Eingangsspannungsbereich: 500–2.500 V Eingangsimpulsbreitenbereich: 1–100 ms Eingangsimpulsanzahlbereich: 1–10“ Leider kann dies sehr leicht missverstanden werden. Mir war nicht klar, dass man die drei Parameter innerhalb dieser Bereiche nicht beliebig kombinieren kann. Man sollte meinen, dass Life Technologies über bessere technische Redakteure verfügt (aber vielleicht benutzen sie das Gerät ja gar nicht …). Fazit: Das Gerät ist für alles andere als Säugetierzellen völlig unbrauchbar. Auch einige andere interessante Anwendungen (z. B. die Elektroporation von Fadenwürmern oder anderen kleinen Lebewesen) sind schwierig oder unmöglich. Das Gerät mag zwar für viele Säugetierzellen eine gute Wahl sein, ist aber weitaus eingeschränkter als der altbewährte BioRad Gene Pulser II. P.S.: Ich habe die Pipettierstation mit Puffer E befüllt (zur Verwendung mit 10-µl-Spitzen). Allerdings habe ich statt Puffer E auch eine Mischung aus 90 % 150 mM Natriumchlorid und 10 % Glycerin getestet (die mir die gleiche Leitfähigkeit wie Puffer E liefert). Dennoch würde ich wirklich gerne die Zusammensetzung von Puffer R wissen. Warum? Weil ich glaube, dass die Spitzenelektroden öfter als nur zweimal wiederverwendet werden können (andere Hersteller von Pipettenspitzenelektroden werben damit, dass ihre Elektroden viel öfter wiederverwendet werden können (z. B. der BactoZapper , obwohl auch sie keine genauen Zahlen nennen). Im Neon-Handbuch heißt es: „Bei mehr als zweimaligem Gebrauch der Spitzen kann es zur Oxidbildung an der Kolbenoberfläche kommen, was die Elektrodenfunktion des Kolbens beeinträchtigt.“ Die Elektrode ist vergoldet, und Gold sollte widerstandsfähiger gegen Oxidbildung sein als die Edelstahlelektroden des BactoZapper…

2-wöchiger Laborkurs

Tue, 30 Dec 2014 00:00:00 +0000

Ich hatte keine Ahnung, wie viel Arbeit es macht, einen praktischen Laborkurs zu organisieren. Hätte ich das gewusst, hätte Pirjo es viel schwerer gehabt, mich davon zu überzeugen, diesen Kurs für das DPBM-Graduiertenkolleg zu veranstalten. Kari hatte mich gewarnt… Der dazugehörige Vorlesungskurs hatte von September bis November stattgefunden. Der Praktikumskurs war mit 16 freien Plätzen ausgeschrieben worden, doch das war völlig unrealistisch, da wir auf meine 23,7 Quadratmeter Laborfläche beschränkt waren. Es gibt zwar Lehrlaborräume, aber ohne die Ausrüstung und die gesamte sonstige Infrastruktur, die für ein solches Vorhaben erforderlich ist. Acht Personen hatten sich für den Praktikumskurs angemeldet, und – glücklicherweise – sprang die Hälfte davon in letzter Minute ab, da sie sich der hohen Arbeitsbelastung, die der Kurs erforderte, nicht in ausreichendem Maße widmen konnten. So blieben schließlich vier Studierende und drei Projekte übrig. Mit mehr hätten wir es auf keinen Fall geschafft. Die Idee war, jedem Teilnehmer die Möglichkeit zu bieten, sein eigenes Projekt zur DNA-Klonierung und Proteinexpression zu realisieren – etwas, das für sein eigenes Promotionsstudium relevant wäre. Zu diesem Zweck hatte ich einen Monat im Voraus Besprechungen mit den drei Gruppen, um die Klonierung zu planen und die notwendigen Materialien zu bestellen. Wir arbeiteten parallel an den folgenden drei Projekten:

Die Argumente gegen FastDigest®

Wed, 25 Jun 2014 00:00:00 +0000

Restriktionsenzyme sind nach wie vor wichtig

Im Jahr 2006 brachte das innovative litauische Biotech-Unternehmen Fermentas eine neue Produktlinie für Forscher im Bereich der Molekularbiologie auf den Markt: die FastDigest-Restriktionsenzyme. Zusammen mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) sind Restriktionsenzyme (REs) wohl die wichtigsten Werkzeuge der Molekularbiologie. Sie ermöglichten Anfang der 1970er Jahre die Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie. Bis sich jedes Labor einen zuverlässigen DNA-Laserdrucker leisten kann (was wahrscheinlich noch ein Jahrzehnt dauern wird), sind Restriktionsenzyme die Werkzeuge des Handwerks. Neuartige Klonierungstechniken (wie In-Fusion , Gibson-Assembly oder SLICE ) haben zwar ihre Berechtigung, lassen jedoch die Robustheit der traditionellen Restriktionsenzym-Klonierung vermissen.

Entlacken

Fri, 01 Nov 2013 00:00:00 +0000

Das erneute Blotten von Membranen mit einem anderen Antikörper ist im Labor eine sehr häufige Aufgabe. Es gibt verschiedene Protokolle zum Strippen von Membranen, wobei die klassische Methode die Verwendung von SDS, β-Mercaptoethanol und Erhitzen vorsieht. Früher habe ich es auch so gemacht, aber das ist eine übelriechende Angelegenheit, da β-Mercaptoethanol nach faulen Eiern riecht. Dann fingen plötzlich alle im Labor an, die Re-Blot Plus von Millipore zu verwenden – und ich auch. Bis ich beim Durchlesen des Sicherheitsdatenblatts feststellte, dass sie billige Chemikalien zu einem überhöhten Preis verkaufen. Jetzt stelle ich den Stripping-Puffer selbst her. Meine 10-fache Lösung hat folgende Zusammensetzung: