2 viikon laboratoriokurssi

En ollut lainkaan tietoinen siitä, kuinka paljon työtä käytännön laboratoriokurssin järjestäminen vaatii. Jos olisin tiennyt, Pirjo  olisi joutunut paljon vaikeampaan tilanteeseen yrittäessään suostutella minua pitämään tämän kurssin DPBM-tohtorikoululle  . Kari  oli varoittanut minua… Kurssiin liittyvä luentokurssi oli ollut käynnissä syyskuusta marraskuuhun. Käytännön kurssille oli tarjolla 16 vapaata paikkaa, mutta se oli täysin epärealistista, kun otetaan huomioon, että meidän tilamme rajoittuivat minun 23,7 neliömetrin laboratorioon. Opetuskäyttöön tarkoitettua laboratoriotilaa on saatavilla, mutta ilman laitteita ja kaikkea muuta tällaiseen hankkeeseen tarvittavaa infrastruktuuria. Käytännön kurssille ilmoittautui kahdeksan henkilöä, ja – onneksi – puolet heistä perui osallistumisensa viime hetkellä, koska heillä ei ollut riittävää mahdollisuutta sitoutua kurssin vaatimaan raskaaseen työmäärään. Näin ollen meillä oli lopulta neljä opiskelijaa ja kolme projektia. Emme olisi missään nimessä selvinneet enempää.Ajatuksena oli tarjota jokaiselle osallistujalle mahdollisuus toteuttaa oma DNA-kloonaus- ja proteiini-ilmentymisprojekti, joka olisi merkityksellinen hänen omille tohtoriopintoilleen. Tätä varten tapasin kolme ryhmää kuukautta etukäteen kloonauksen suunnittelemiseksi ja tarvittavien materiaalien tilaamiseksi. Työskentelimme rinnakkain seuraavien kolmen projektin parissa:

1. MSP1:n ilmentäminen CHO-soluissa (sekä väliaikaisesti että pysyvästi)
2. Ihmisen AR:n ilmentäminen 293T-soluissa (väliaikaisesti)
3. Plasmidin tuottaminen, joka voidaan pilkkoa restriktioentsyymillä täysin tasavälein jakautuneeksi DNA-tikkaaksi

Kun menin City Labiin ostoslistani kanssa, Thermo Fisher  järjesti myyntinäyttelyn (kaikista entsyymeistä -33 % alennus). Tein tilauksen Fisher Scientificilta ja ilmoitin myyntiedustajalle selvästi, että tarvitsisin tuotteet viikkoa ennen kurssin alkua, ja myyntiedustaja vahvisti, ettei kaikkien tuotteiden toimittaminen ajoissa olisi lainkaan ongelma. Todellisuudessa toimitus jaettiin kahteen osaan: alennetuista tuotteista ja alennuksettomista tuotteista. Vaikka tein tilaukset molemmista osista, vain alennetut tuotteet päätyivät Thermo Fisherin sisäiseen tilausjärjestelmään Thermo Fisherin puolella tapahtuneen virheen vuoksi. Kun toimitus saapui, kaikki tuotteet laitettiin pakastimeen/jääkaappiin, mutta kukaan ei tullut ajatelleeksi tarkistaa, oliko kaikki tuotteet toimitettu. Kun tarkistin kurssia edeltävänä viikonloppuna, oliko kaikki tilaamamme tavarat saapuneet, huomasin, että tavaroita puuttui… Ja aloin juosta ympäriinsä yrittäen varmistaa, että saamme lainattua kaikki materiaalit, joita ei ollut vielä saapunut. Thermo Fisheriltä kesti 10. joulukuuta asti, ennen kuin kaikki tuotteet saatiin toimitettua. Siihen mennessä olimme jo tehneet suurimman osan siitä, mitä olimme suunnitelleet.

Toinen harmi oli se, että Dharmacon/GE Healthcare  ei pystynyt toimittamaan ihmisen androgeenireseptorin cDNA:ta ( BC132975  , kloonitunnus: 40146997) Mammalian Gene Collectionista  . GE Healthcare ilmoittaa sivuillaan: ”Toimitus Pohjois-Amerikkaan 2 päivässä (lisää yksi viikko Pohjois-Amerikan ulkopuolelle)”. Vaikka kaksinkertainen aika oli jo kulunut, toimitusta ei ollut tapahtunut, ja muutama päivä ennen kurssin alkua yritin hädissäni keksiä korvaavaa projektia. Onnistuin saamaan rotan androgeenireseptorin cDNA:n Päivi Pihlajamaalta, ja kurssia edeltävänä perjantaina Tapio sekvensoikin vielä konstruktin liitoskohdat. Konstruktin näytti olevan kloonattavissa; tein DNA-valmistelun viikonlopun aikana ja suunnittelin kloonaussuunnitelman uudelleen. GE Healthcare pahoitteli syvästi kyvyttömyyttään toimittaa tuotetta ja lupasi toimittaa ihmisen androgeenireseptorin ilmaiseksi (mutta ei ole tehnyt niin tähän mennessä)…

Kurssin aikataulu oli erittäin tiukka eikä sallinut minkäänlaisia virheitä. Useita kertoja ajattelin, että projekti päättyisi ennenaikaisesti. Pidän edelleen merkittävänä sitä, että projektit 1 ja 2 sujuivat suunnitelmien mukaisesti loppuun asti. Tiukimmalla hetkellä olimme jo ykkösprojektin ensimmäisessä kloonausvaiheessa: Kloonaus oli suuntaamatonta, ja valitsimme useita klooneja varmistaaksemme, että löytäisimme hyvän suuntauksen. Yhdeksässä kloonissa oli insertti, kahdeksassa väärässä suunnassa ja yhdessä (klooni 4) oikeassa suunnassa. Samassa kloonausvaiheessa lisäsimme kloramfenikoliresistenssin, mutta opiskelijat levittivät viljelmät iloisesti ampisilliinilevyille, vaikka olisivat voineet vähentää taustakohinaa nollaan käyttämällä ampisilliini/kloramfenikolilevyjä. Niistä 40 pesäkkeestä, jotka heidän piti valita minipreppejä varten, vain noin 10 kasvoi, kun käytimme viljelyssä molempia antibiootteja. Transfektio ja detektio sujuivat ongelmitta.

Lopullisessa kuvantamisessa käytimme Licorin Odyssey Fc-laitetta  , jonka tutkimusohjelmamme oli hankkinut muutama viikko aiemmin, ja olin yllättynyt sen suuresta herkkyydestä (otin ECL-kalvon ja valotin sen röntgenfilmille saadakseni käsityksen siitä, miten ne eroavat toisistaan). Meillä ei ollut muuta vaihtoehtoa kuin keskeyttää projekti 3 kahden ensimmäisen kloonausvaiheen jälkeen (kolmesta). Kun tarkistimme pOTB7-BglI2x-insert-konstruktin sekvenssit, löysimme mutaation yhdestä BglI-päällekkäisyydestä (tämä mutaatio ei vaikuta katkaisutoimintaan, mutta vaikuttaa ligaatioyhteensopivuuteen). Sekvensoimme vielä kaksi muuta konstruktia, mutta niissä kaikissa ilmeni sama mutaatio, ja huomasimme, että alkuperäinen konstrukti (pOTB7-PC5) sisälsi jo tämän mutaation. Koska viimeisessä kloonausvaiheessa olemme riippuvaisia juuri tästä BglI-kohdasta syntyvästä spesifisestä ulokkeesta, emme voineet jatkaa ilman tämän mutaation korjaamista. Tilasimme mutageneesin oligonukleotidit välittömästi, mutta tämän kurssin osalta projekti oli päättynyt. Koska Girma on edelleen sitoutunut saattamaan tämän projektin loppuun, korjaamme ongelman ja suoritamme puuttuvan viimeisen kloonausvaiheen. Olisi mukavaa saada oma, tasavälein sijoitettu DNA-markkeri, joka on valmistettu DNA-konstruktin restriktiokäsittelyllä. Sitä kaikki käyttivät 25 vuotta sitten: Lambda HindIII:ta tai jotain vastaavaa. Ainoastaan fragmenttien välimatkat eivät koskaan olleet kovin hyviä. Meidän versiossamme tasavälein sijoittuvasta DNA-tikkaasta voimme kloonata HindIII/SpeI-fragmentin perusvektoriimme (pOTB7-BglI2x) ja toisessa ketjuttavassa ligaatiovaiheessa HindIII/SpeI-fragmentin pituus määrää tuloksena olevan tikkaan kokovälit. Tällä kurssilla käytimme 350 bp:n fragmenttia, joka olisi tuottanut meille seuraavanlaisen DNA-tikkaan: 350, 700, 1050, 1400, 1750, 2100 jne. Kun olemme saaneet tämän konstruktin valmiiksi, kaikki opiskelijat saavat plasmidiin ja osan valmiista tikkaista muistoksi. Koska tämän tikkaan valmistuskustannukset ovat noin 40 kertaa pienemmät kuin kaupallisen DNA-tikkaan ostaminen, voisimme jopa alkaa jakaa sitä ilmaiseksi.

Jotkin asiat tämän kurssin valmistelussa olisivat voineet sujua helpommin: Vasta kurssin viimeisenä päivänä sain Gretchen Repaskyltä ”DPBM-oppaan kurssijärjestäjille”. Miksi en ole koskaan tiennyt, että jotain sellaista on olemassa????? Johanna Timmerbacka, edellinen jatko-opintokoordinaattori, on varmaan miettinyt samaa: kysyin häneltä sähköpostitse kaikki kysymykset, joihin tämä opas vastaa… Tämän kertomuksen liitteenä ovat kloonaussuunnitelmat ja kurssin aikataulu. Protokollakokoelma ja lyhyt kuvaus tuloksista lisätään mahdollisimman pian kurssin jälkeen. Lisäksi on viitettä ( Yhdysvaltain patenttivirastolta  ja Journal of Nucleic Acids -lehdestä  ) kahdesta vaihtoehtoisesta tavasta luoda DNA-tikkaat. Yhteenvetona: Ensi vuonna emme tee mitään märkälabrassa. Istumme tietokoneiden ääressä. Ehkä. Jos löydämme Biomedicumista opetustilan, jossa on projektori, jonka resoluutio on suurempi kuin 1024x768.