HiLoad 26/60 Superdex pg -geelisuodatuskromatografiakolonnin suorituskyky

Yleisin käyttämämme proteiinien puhdistustekniikka on geelisuodatus (jota kutsutaan myös kokosuodatuskromatografiaksi). Geelisuodatuksessa proteiinit erotellaan niiden koon perusteella (tai tarkemmin sanottuna niiden ”Stokesin säteen” perusteella, joka määräytyy suurelta osin niiden koon ja muodon mukaan). Suurten proteiinimäärien geelisuodatusta varten hankimme GE Healthcaren HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade  noin 9 vuotta sitten (malli 26/60 on korvattu mallilla HiLoad 26/600, mutta molemmat ovat lähes identtisiä). Tällä kolonnilla voidaan erottaa erittäin puhtaasti kaksi proteiinia, joiden kokero ero on 100 %. Siksi se sopii saman proteiinin monomeeristen ja dimeeristen versioiden erottamiseen. Kolonnin ”viimeinen käyttöpäivä” oli maaliskuu 2012. Kokemuksemme mukaan tällainen kolonnin käyttöikä voi asianmukaisessa käsittelyssä helposti olla 10–15 vuotta (emme käytä sitä kovin usein, säilytämme sitä 20-prosenttisessa etanolissa, ja jos emme tarvitse sitä pidempään aikaan, säilytämme sitä +4 °C:ssa).

Huolimatta sen erinomaisesta suorituskyvystä ja ilman mitään ilmeistä syytä havaitsimme viime vuoden lopulla erottelukyvyn jyrkän heikkenemisen, jolloin tutkimamme PET-proteiinin VEGF-C:n dimeeri- ja monomeeripiikit menivät huomattavasti päällekkäin. Testasimme kolonnia geelisuodatuskolonnin vakiotestillä  (0,5 ml 2-prosenttista asetoninäytettä) ja havaitsimme, että kolonnista oli jäljellä vain noin 1400 teoreettista levyä metriä kohti (TP/m) (GE lupaa uudelle kolonnille >13000). Ongelman syyn selvittämiseksi injektoimme 20-prosenttista bromifenolisinistä 20-prosenttisessa etanoli-liuoksessa ja havaitsimme, että ongelma syntyi kolonnin yläosassa, jossa näyte tuli geelikerrokseen (katso kuva yllä).Muovisen mäntän (katso kuva vasemmalla) pohja on peitetty renkaalla, jossa on tiheäsilmäinen muoviverkko, ja tämän verkon ja mäntän liitoskohdasta näyte vuoti epäsäännöllisesti aiheuttaen suuren hännän (ja siten leveitä, epäsymmetrisiä piikkejä). Vaihdoimme verkkorenkaan varaosaan, mutta tilanne ei parantunut lainkaan, vaan massiivista vuotamista esiintyi edelleen. Epäilin, että varaosa ei ollut enää käyttökelpoinen, sillä se oli tullut kolonnin mukana ja vanhentunut menettäen pehmittimensä. Se oli erittäin jäykkä eikä joustava, ja jo työntäessäni sitä mäntään epäilin, ettei se tiivistäisi riittävän hyvin. Odotellessamme uutta pakkausta uusia verkkorenkaita yritimme leikata oman tiivisteen parafilmistä. Se todellakin paransi TP/m-arvoa 1400:sta 2800:aan, mutta havaitsimme edelleen paljon vuotoa. Kun lopulta vaihdoimme sekä mäntän että verkkorenkaan uusiin varaosiin, mitasimme noin 17 000 TP/m. Huippu muuttui jälleen symmetriseksi ja kapeaksi, mikä oli havaittavissa jo paljaalla silmällä (kuva oikealla). Olimme kuitenkin yllättyneitä siitä, että mäntän välistä tapahtui edelleen vuotoa (katso alla), vaikkakin paljon pienemmällä nopeudella ja paljon tasaisemmin. Mietin, esiintyykö tätä ”perusvuotoa” myös täysin uusissa kolonneissa.

En tiedä tätä, koska emme testanneet kolonnia värillisillä liuoksilla, kun se oli uusi. Teimme vain asetonitestin ja toimintatestin Sigman geelisuodatuskalibrointipakkauksen  proteiineilla. Myöskään tavanomaista asetonitestiä ei voi verrata siihen, mitä nyt havaitsemme, koska se tehtiin eri laitteella ja eri letkuilla (ja se voi vaikuttaa erottelukykyyn varsin merkittävästi). Jos uusissakin kolonneissa esiintyy tällaista taustaviivan vuotoa, GE:llä on vielä parantamisen varaa kolonnin suunnittelussa, ja mietin, kuinka paljon parempi erottelukyky voisi olla, jos näytteen ruiskuttaminen voitaisiin toteuttaa hallitummin. Mielenkiintoista on, että GE Healthcare on maailmanlaajuinen monopolisti näiden suurten kolonnien alalla (korjatkaa minua, jos olen väärässä, sillä näiden GE-kolonnien hinta on huikeat noin 3000 €). Pienempien geelisuodatuskolonnien osalta kilpailua on (esim. Tosoh  ), mutta kukaan muu kuin GE Healthcare ei tarjoa 60 cm:n (tai pidempiä) geelisuodatuskolonneja, joiden näytekapasiteetti on näin suuri (2–5 ml).