Kuinka paljon PCR-tuotetta saadaan tyypillisestä PCR-reaktiosta?
Kuva Michael JeltschKuinka paljon PCR-tuotetta tyypillisestä PCR-reaktiosta saadaan? 50–120 ng/µl näyttää olevan tyypillinen tulos, mutta se riippuu suuresti käytetyistä PCR-olosuhteista. Jos alukepitoisuutta on vähennettävä spesifisyyden maksimoimiseksi, saanto voi olla huomattavasti pienempi. Toisaalta, jos spesifisyys ei ole ongelma (esim. joissakin PCR-kloonauksissa), saanto voi olla moninkertainen.Tarkastellaan tyypillistä yhden PCR-reaktion enimmäismäärää, joka on 100 µl. Oletetaan, että spesifisyys ei ole ongelma ja voimme siksi käyttää suuria määriä alukkeita (kumpikin 1 µM) ja dNTP:itä (0,2 µM). Koska jokaisen kaksisäikeisen PCR-tuotteen molekyylin synteesi kuluttaa yhden alukkeen, kaksisäikeisen (ds) DNA-tuotteen teoreettinen suurin moolikonsentraatio on sama kuin alukkeen pitoisuus: 1 µM. 1 µM dsDNA:ta vastaisi 100 pmolia 100 µl:n PCR-reaktiossa. Kuinka paljon se on mikrogrammoina? Se riippuu tietysti PCR-tuotteen pituudesta: esimerkiksi 100 pmol 1000 bp:n dsDNA:ta vastaa 66 µg. Voiko todella saada niin paljon? Ei tässä 1000 bp:n tuotteen esimerkissä. Syynä on se, että DNA:n rakennuspalikat, dNTP:t, loppuvat kauan ennen alukkeita. 1000 bp:n tuotteen tapauksessa vain 40 % alukkeista on käytetty loppuun, kun dNTP:t loppuvat (olettaen, että amplikonin GC:n ja AT:n suhde on 50:50). Yhden 1000 bp:n dsPCR-tuotteen molekyylin valmistamiseen tarvitaan noin 2000 dNTP-molekyyliä. Esimerkissämme 400 bp:n PCR-tuote olisi siis optimaalinen, koska sekä alukkeet että dNTP:t loppuvat samaan tahtiin.Vaikuttaa siltä, että jos haluat saada suurempia määriä pidempiä PCR-tuotteita, sinun pitäisi lisätä dNTP-pitoisuutta. Kuitenkin esimerkissämme, jossa tuotteen pituus on 1000 bp, PCR-tuotteen teoreettinen enimmäismäärä on noin 26 µg, mikä on valtava määrä ja riittää useimpiin sovelluksiin. Verkossa on laskin, jonka avulla voi kokeilla eri alukkeiden ja dNTP-pitoisuuksien sekä tuotteen pituuksien yhdistelmiä:
http://www.bioline.com/us/media/calculator/01_14.html
