Lymfologinen (perus)tutkimus: miten se toimii?

Esitelmä Saksan lymfologian seuran 43. vuosikongressissa  

PD Dr. Michael Jeltsch Helsingin yliopisto & Wihuri-tutkimuslaitos Haartmaninkatu 8 FIN-00290 Helsinki, Suomi michael@jeltsch.org

Tiede perustuu aiemman tutkimuksen tuloksiin; olemme kääpiöitä jättiläisten hartioilla [1]. Tämän esitelmän tarkoituksena on osoittaa, kuinka siirrymme kysymyksestä toiseen ja lähestymme näin hitaasti ja mutkikkaita reittejä pitkin kokonaisvaltaista ymmärrystä imusuonijärjestelmästä.VEGF-C/VEGFR-3-signaalinvälitysketjun geenit voivat olla mutaatioiden kohteena, jotka ilmenevät suoraan perinnöllisinä lymfedeemeinä tai altistuksena hankituille lymfedeemeille. Esimerkiksi kasvutekijän VEGF-C:n (Vascular Endothelial Growth Factor-C)[2] ja sen reseptorin VEGFR-3:n [3] mutaatiot aiheuttavat perinnöllisiä lymfedeemoja. Vuonna 2009 CCBE1-geenin mutaatiot tunnistettiin Hennekam-oireyhtymän (pääoire: yleistynyt lymfedeema) syyksi [4]. Tämän seurauksena olemme tutkineet Hennekam-oireyhtymän molekyylipatogeneesiä. Tärkeimmät tulokset: 1) VEGF-C:n on läpäistävä entsymaattinen pilkkoutuminen aktivoituakseen, 2) vastuussa oleva entsyymi on ADAMTS3, 3) CCBE1 nopeuttaa VEGF-C:n aktivoitumista [5]. Nopeuttamisen toimintamekanismia ei aiemmin tunnettu. CCBE1-proteiini koostuu kahdesta eri osasta (”domeenista”). Eri laboratoriot olivat erimielisiä siitä, kumpi domeeneista aiheuttaa aktivoinnin nopeutumisen [6,7]. Lopulta kävi ilmi, että molemmat domeenit kiihdyttävät VEGF-C:n aktivoitumista toisistaan riippumatta. N-terminaalinen domeeni tekee tämän esimerkiksi keskittämällä VEGF-C:n ja ADAMTS3:n solujen pinnoille [8]. CCBE1- ja ADAMTS3-knockout-hiiret [9,10] vahvistivat tuloksemme: näissä hiirissä imusuonisto ei kehity. Sen jälkeen halusimme selvittää, onko ADAMTS3:n lisäksi muita entsyymejä, jotka aktivoivat VEGF-C:tä. Oletimme, että tällaiset entsyymit saattaisivat olla mukana patologisessa imusuonten kasvussa kasvainsairauksissa tai haavan paranemisessa.Oikealle jäljelle johdatti meidät Matsumura et al., joka oli seulonut tetrapeptidikirjaston kallikreiinin kaltaisen peptidaasi 4:n (KLK4) avulla ja sen perusteella ehdottanut noin 70 potentiaalista substraattia KLK4:lle, mukaan lukien VEGF-C [11]. Testasimme KLK4:ää tuloksettomasti, mutta naapurilaboratoriomme KLK3 (= eturauhaskohtainen antigeeni) osoittautui onnistuneeksi. PSA:n fysiologinen tehtävä on ejakulaatin nesteyttäminen, jotta siittiöt voivat uida. Löysimme huomattavia määriä VEGF-C:tä siemennesteestä, ja ne aktivoituivat samanaikaisesti ejakulaatin nesteytymisen kanssa [12]. Lisääntymiseen liittyvän potentiaalisen tehtävän lisäksi VEGF-C voisi (lymfa-)angiogeenisen potentiaalinsa ansiosta luoda toistaiseksi määrittelemättömän yhteyden PSA-arvojen ja eturauhassyövän ennusteen välille. Tutkituista muista kehon nesteistä sylki aktivoi VEGF-C:tä erittäin tehokkaasti. Tunnistimme aktivoivaksi proteaasiksi katepsiini D:n [12]. Työhypoteesimme on, että haavan nuoleminen aktivoi inaktiivisen, solunulkoiseen matriisiin kertyneen VEGF-C:n ja nopeuttaa siten haavan paranemista. Lisäksi on mielenkiintoista, että katepsiini D yhdistettiin jo 30 vuotta sitten imusolmukkeisiin leviävään rintasyöpään [13]. Seuraavissa kokeissamme selvitetään, mitkä proteaasit aktivoivat VEGF-C:tä todellisissa kasvaimissa ja voidaanko imusolmukkeisiin leviävää kasvaimen etäpesäkkeiden muodostumista estää tai viivästyttää spesifisillä proteaasi-inhibiittoreilla.

Lähdeluettelo  

1. Kääpiöt jättiläisten hartioilla. Wikipedia (2019). https://de.wikipedia.org/wiki/Zwerge_auf_den_Schultern_von_Riesen 
2. Gordon, K. et al. Vaskulaarisen endoteelisen kasvutekijän C:n (VEGF-C), joka on vaskulaarisen endoteelisen kasvutekijän reseptori-3:n ligandi, mutaatio liittyy autosomaaliseen dominanttiin Milroy-tyyppiseen primaariseen lymfedeemaan – Uutuus ja merkitys. Circulation Research 112, 956–960 (2013). https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.113.300350 
3. Karkkainen, M. J. ym. Missense-mutaatiot häiritsevät VEGFR-3-signalointia primaarisessa lymfedeemassa. Nature Genetics 25, 153–159 (2000). https://doi.org/10.1038/75997 
4. Alders, M. et al. CCBE1-geenin mutaatiot aiheuttavat yleistä imusuonten dysplasiaa ihmisillä. Nature Genetics 41, 1272–1274 (2009). https://doi.org/10.1038/ng.484 
5. Jeltsch, M. et al. CCBE1 tehostaa lymfangiogeneesiä A Disintegrin and Metalloprotease With Thrombospondin Motifs-3:n välittämän verisuonten endoteelisen kasvutekijän C aktivaation kautta. Circulation 129, 1962–1971 (2014). https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.113.002779 
6. Bos, F. L. ym. CCBE1 on välttämätön nisäkkäiden imusuoniston kehitykselle ja tehostaa verisuonten endoteelisen kasvutekijän C:n lymfangiogeenistä vaikutusta in vivo – uutuus ja merkitys. Circulation Research 109, 486–491 (2011). https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.111.250738 
7. Roukens, M. G. et al. CCBE1-proteiinin toiminnallinen analyysi. Kollageenitoistojakson ratkaiseva edellytys. Circ Res 116, 1660–1669 (2015). https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.116.304949 
8. Jha, S. K. ym. Lymfangiogeenisen kasvutekijän VEGF-C:n tehokas aktivointi edellyttää VEGF-C:n C-terminaalista domeenia ja CCBE1:n N-terminaalista domeenia. Sci Rep 7, 4916 (2017). https://doi.org/10.1038/s41598-017-04982-1 
9. Janssen, L. et al. ADAMTS3-aktiivisuus on välttämätöntä alkion lymfangiogeneesille ja säätelee istukan angiogeneesiä. Angiogenesis 1–13 (2015). https://doi.org/10.1007/s10456-015-9488-z 
10. Bui, H. M. ym. Proteolyyttinen aktivaatio määrittää VEGFC:n ja VEGFD:n erilaiset lymfangiogeeniset mekanismit. J Clin Invest 126, 2167–2180 (2016). https://doi.org/10.1172/JCI83967 
11. Matsumura, M. et al. Eturauhaskohteisen seriiniproteaasin prostase/KLK4:n substraattien määrittäminen positiotarkistavien peptidikirjastojen avulla. The Prostate 62, 1–13 (2005). https://doi.org/10.1002/pros.20101 
12. Jha, S. K. et al. KLK3/PSA and cathepsin D activate VEGF-C and VEGF-D. eLIFE (2019) https://doi.org/10.7554/eLife.44478  .
13. Spyratos, F. et al. Katepsiini D: itsenäinen ennustetekijä rintasyövän etäpesäkkeiden muodostumiselle. The Lancet 334, 1115–1118 (1989). https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673689914876