Edullinen PCR-pohjainen mutageneesipakkaus

Jos DNA-konstruktia on tarpeen muokata, yksi yleisesti käytetty menetelmä on PCR-pohjainen mutageneesi, jossa mutaatio sijoitetaan kahden komplementaarisen alukkeen väliin. Vaihtoehtoisesti pidempien lisäysten kohdalla voidaan käyttää aluketunnistetta. Sitten amplifioidaan yksinkertaisesti koko konstruktio PCR:llä. Tämä toimii kohtuullisen hyvin konstruktioille, jotka ovat pienempiä kuin noin 10 kb. Tätä tarkoitusta varten on saatavilla useita kaupallisia sarjoja, jotka eroavat toisistaan yksityiskohdissa. Niistä mainittakoon Agilentin QuickChange-sarja  ja NEB:n Q5 SDM -sarja  NEB:ltä sekä Phusion Site-Directed Mutagenesis -sarja  ThermoFisheriltä. QuikChange-pakkaus on kallein (myös siksi, että sen ostaa aina yhdessä kompetenttisolujen kanssa), ja NEB:n pakkaus on melko edullinen (minulle täällä Suomessa 168 €). Useimmat pakkaukset on mitoitettu 10 reaktiota varten. Mutta mitä teet, jos haluat tehdä vain yhden tai kaksi mutageneesireaktiota? Ostatko koko sarjan? Kohtasin tämän kysymyksen kaksi viikkoa sitten. Menin entsyymipakastimeemme ja huomasin, että meillä on T4-DNA-ligaasia, polynukleotidikinaasia (PNK) ja Phusion-polymeraasia. Siinä on kaikki, mitä tarvitset oman kohdennetun mutageneesipakkauksen tekemiseen!

Seurasin Q5 SDM -protokollaa  . Käytin 25 ng templaattia, 17 sykliä ja Phusion-polymeraasia (HF-puskurilla) Q5-entsyymin sijaan. Mallini oli noin 5500 bp pitkä, ja käytin kahta erilaista alukesarjaa kahden eri mutaation aikaansaamiseksi (yksi 6 bp:n lisäys ja yksi 21 bp:n lisäys).Molemmissa alukkeissa lisäysosa on yksinkertaisesti kiinnitetty tunnisteena yhden alukkeen 5’-päähän.Kinaasi-, ligaasi- ja templaatin hävitysreaktio suoritettiin 2 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen transformoin itse valmistamiani kompetentteja E. coli -bakteereita (joiden kompetenssi oli alle 1 miljoonaa cfu/µg pUC19-DNA:ta).1 µl puhdistamatonta PCR-tuotetta, 0,5 µl 10x PNK-puskuria, 0,5 µl 10x T4-ligaasipuskuria, 0,5 µl 10 mM ATP:tä, 0,5 µl T4 PNK:ta (NEB, 10 U/µl, viimeinen käyttöpäivä 9/2018) 0,5 µl DpnI:tä (NEB, 20 U/µl, viimeinen käyttöpäivä 10/2000)1 µl T4-ligaasia (Thermo Fisher, 5 U/µl) 5,5 µl vettä Vertailureaktiossa korvasin PNK:n ja ligaasin 50-prosenttisella glyserolilla. Halusin selvittää, kuinka suuri osa templaattia selviää DpnI-pilkkomisesta. kontrollilevy: 2 pesäkettä, 6 bp:n insertti: 130 pesäkettä, 10 bp:n insertti: 87 pesäkettäKasvatin 6 kloonia 10 bp:n inserttia varten ja 4 kloonia 6 bp:n inserttia varten. Tein restriktiokäsittelyn varmistaakseni, että insertiomutageneesi oli onnistunut. Neljästä 6-bp-insertion-kloonista kolmessa ja kuudesta 10-bp-insertion-kloonista kolmessa näkyi oikea pilkkoutumiskuvio. Sekvenssoin myös yhden valitun kloonin koko PCR:llä saadun DNA:n molemmista mutageneesireaktioista. Molempien kloonien sekvenssi oli 100-prosenttisesti oikea. Laskelmieni mukaan ja riippuen siitä, miten olet hankkinut yksittäiset entsyymit, tämä menetelmä maksaa 10–20 % kunkin yksittäisen mutageneesireaktion testipakkauksen hinnasta (minun tapauksessani noin 3 €/reaktio).