PÄIVITYS: Emme ole ainoita, jotka pyrkivät säästämään toimintakustannuksissaan.
Kuva Michael JeltschPÄIVITYS: Emme ole ainoita, jotka pyrkivät säästämään toimintakustannuksissaan. Tämä laboratorio julkaisi Neon-järjestelmällä tekemänsä kokeet lehdessä
Analytic Biochemistry
. Kiitos Joachim Goedhartille (
@joachimgoedhart
), joka toi tämän tietoon!
Neon-transfektiolaite
valmistajalta
Life Technologies
(oho, nykyään
Thermo Fischer
ja aiemmin
Invitrogen
) tuotiin markkinoille noin viisi vuotta sitten. Se on suunniteltu nisäkässolujen helppoon elektroporointiin. Laite on ollut käytössämme vuodesta 2011 lähtien, mutta sitä ei ole juurikaan käytetty. En tiedä, johtuuko laitteen vähäinen käyttö sen käyttäjäepäystävällisyydestä (en vieläkään osaa kiinnittää elektrodin kärkeä pipettiin, vaikka olen tehnyt tämän satoja kertoja, mekaniikka on vain todella hankalaa), kalliista käyttökustannuksista (kertakäyttöisistä kullatuista elektrodeista ja valmistajan omasta transfektiopuskurista) vai jostakin muusta, jota en osaa selvittää. Haluaisin kuitenkin jakaa muutaman asian, sillä verkosta löytyy vain vähän todella hyödyllistä tietoa Neon-laitteesta.Ensimmäinen asia, josta meillä oli jatkuvasti ongelmia, olivat elektrodikärjessä olevat ilmakuplat, jotka johtavat katastrofaalisesti alhaiseen elektroporointitehokkuuteen. Ainoa tapa todella estää tämä on valmistaa vähintään 25 % enemmän solususpensiota kuin mitä tosiasiassa tarvitaan. Jos valmistat vain 10 % enemmän, viimeisessä elektroporoinnissa syntyy varmasti kipinöintiä väistämättömien ilmakuplien vuoksi (solususpensio tarttuu lisäksi helposti pipetin kärjen ulkopintaan, mikä lisää tarvetta valmistaa enemmän kuin todellisuudessa tarvitaan). Tämän seurauksena elektroporointipuskuri R loppui meiltä kauan ennen kuin pipetin kärjet loppuivat. Lisäksi puskuria R ei voi ostaa erikseen. Life Technologiesin edustaja, jonka kanssa olin yhteydessä, lupasi lähettää meille pienen erän pipetin kärkiä ja puskuria hyvän tahdon eleenä (se oli tammikuussa), mutta odotamme yhä niiden saapumista…Valitettavasti vanha
Gene Pulser II
-elektroporaatiolaite rikkoutui äskettäin.
Bio-Rad
ei enää korjaa sitä eikä myöskään toimita varaosia. Sitä käytettiin pääasiassa E. coli:n elektroporointiin. Tiesin, että Neon-laitetta ei ole suunniteltu E. coli:n elektroporointiin. Miksi ei, ja miksi sitä ei voi käyttää tähän tarkoitukseen? Kävi ilmi, että sähkökentän voimakkuus ei riitä läheskään E. coli:lle (BioRad Gene Pulser II:ssa tyypillisessä bakteerien elektroporoinnissa saavutetaan 12,5 kV/cm:n sähkökenttä, kun taas Neon saavuttaa hädin tuskin noin 850 V/cm). Kuitenkin (ajattelin), Neon pystyy tuottamaan paljon pidempiä pulsseja kuin Gene Pulser II (Neonin mainostetaan pystyvän tuottamaan jopa 100 ms:n pulsseja, kun taas Gene Pulser II:n tyypillinen pulssin pituus on noin 5 ms). Tämän lisäksi Neon pystyy lähettämään automaattisesti useita pulsseja. Halusin siis testata, voiko pitkä ja/tai toistuva pulssi, jonka kenttävoimakkuus on pienempi, transfektoida E. coli -bakteeria. Kävi kuitenkin ilmi, että kun E. coli:n transfektiopuskurina käytetään vettä (tai 10-prosenttista glyserolia) – kuten yleensä tehdään – laite ilmoittaa, ettei kärkielektrodi ole kosketuksessa. Tämä johtuu siitä, että laite tarkistaa, onko kärki asetettu oikein, lähettämällä pienen virran järjestelmän läpi, eikä virta kulje, jos E. coli on suspendoitu veteen. Jotta laite ”hyväksyisi” asetetun pipetin kärkielektrodin, tarvitaan 10–20 mM NaCl:ää. Käytin siis 15 mM natriumkloridia E. coli:n elektroporointipuskurina ja asetin elektroporointiparametrit arvoihin 2500 V ja 100 ms. Yllätys: Laite kieltäytyy antamasta tällaista pulssia, koska se on ”tehorajan yläpuolella!”. Suurin pulssin kesto, jonka se voi tuottaa 2500 V:n jännitteellä, on 19 ms. Valitettavasti edes tätä pulssia ei voida antaa automaattisesti useita kertoja (jälleen: ”tehorajan yläpuolella!”). Siksi suoritin tämän pulssin manuaalisesti 1–20 kertaa, mutta yksikään bakteeri ei saanut DNA:ta ja kaikki bakteerilevyt jäivät tyhjiksi. Käyttöohjeessa todetaan: `”Neon TM -laite on suunniteltu hyväksymään vain tiettyjä arvoja, ja kunkin arvon raja-arvot on lueteltu alla. Jos syöttämäsi arvo ylittää enimmäisarvon, näyttöön tulee virheilmoitus. Syöttöjännitealue: 500–2 500 V. Syöttöpulssin leveysalue: 1–100 ms. Syöttöpulssien lukumääräalue: 1–10.” Valitettavasti tämä voidaan ymmärtää hyvin helposti väärin. Minulle ei ollut selvää, ettei näiden alueiden sisällä olevia kolmea parametria voi yhdistellä vapaasti. Luulisi, että Life Technologylla olisi parempia teknisiä kirjoittajia (mutta ehkä he eivät käytä laitetta…). Johtopäätös: Laite on täysin käyttökelvoton mihinkään muuhun kuin nisäkässoluihin. Myös jotkut muut mielenkiintoiset sovellukset (kuten sukkulamatojen tai muiden pienten eliöiden elektroporaatio) ovat vaikeita tai mahdottomia. Vaikka laite saattaa olla hyvä valinta monille nisäkässoluille, se on paljon rajoitetumpi kuin vanhanaikainen BioRad Gene Pulser II. P.S.: Käytin puskuria E pipettiaseman täyttämiseen (käytettäväksi 10 µl:n kärkien kanssa). Testasin kuitenkin puskurin E sijaan myös seosta, jossa oli 90 % 150 mM natriumkloridia ja 10 % glyserolia (joka antaa saman johtavuuden kuin puskuri E). Haluaisin kuitenkin edelleen todella tietää puskurin R koostumuksen. Miksi? Koska uskon, että kärkielektrodeja voidaan kierrättää useammin kuin vain kaksi kertaa (muut pipettikärkielektrodien valmistajat mainostavat, että heidän elektrodejaan voidaan kierrättää paljon useammin (esim.
BactoZapper
, vaikka hekään eivät anna tarkkoja lukuja). Neonin käyttöohjeessa todetaan, että ”jos kärkiä käytetään useammin kuin kaksi kertaa, männän pinnalle voi muodostua oksidia, mikä heikentää männän elektrodin toimintaa”. Elektrodi on kullattu, ja kullan pitäisi kestää oksidien muodostumista paremmin kuin BactoZapperin ruostumattomasta teräksestä valmistetut elektrodit…
