FPLC-proteiinien puhdistuskurssi

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Kahdeksan jatko-opiskelijaa ilmoittautui joulukuussa järjestettyyn FPLC-proteiinipuhdistuskurssille . Jos jotain opin, niin sen, että kurssin aikana tehtävä proteiinien puhdistus tulisi AINA suorittaa käyttämällä proteiinia ja menetelmää, joita on aiemmin käytetty menestyksekkäästi LUKUISIA kertoja. Opiskelijoiden tuomat proteiinit ovat erinomainen oppimisen lähde, mutta kurssimuodon aikarajoitukset eivät antaneet meille mahdollisuutta saada näiden proteiinien puhdistusta valmiiksi kurssin aikana.Uuden Äkta Avant 25:n tekniset ongelmatLisäksi Äkta Avant 25 , jonka ostimme GE Healthcarelta tänä kesänä, rikkoutui KAKSI KERTAA kurssin aikana. Ensin ohjaus tietokone rikkoutui (RAID-vika). HP toimitti korvaavan kiintolevyn 24 tunnin kuluessa, ja kun RAID oli palautunut, pystyimme jatkamaan kurssia. Kuitenkin ensimmäisen tämän vian jälkeisen ajon aikana Äkta-laitteessa ilmeni ylipaineongelma. Tunnistimme syyksi viallisen virtauksenrajoittimen , mutta emme halunneet jatkaa, koska aiemmissa ajoissa oli ollut vakavia ongelmia ilmakuplien kanssa. Siksi suoritimme ajot vanhalla Äkta Explorer 100 -laitteella. GE Healthcare lähetti nopeasti huoltoteknikon tarkastamaan järjestelmän, mutta koska hänellä ei ollut varaosaa mukanaan, jouduimme odottamaan maanantaihin 14.12. asti, kunnes Äkta Avant oli jälleen täysin toimintakunnossa.Mitä puhdistimme: liukoinen VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) ja HepsinPuhdistimme liukoista ihmisen VEGF-reseptoria 3 (sen solunulkoisen domeenin kolme ensimmäistä domeenia, jotka on liitetty ihmisen IgG:n vakio-Fc-osaan). Tämä on puhdistus, jonka olemme tehneet monta kertaa. Se vastaa vasta-aineiden puhdistusta proteiini A-sefarosella.Olimme valmistaneet etukäteen konditionoidun soluviljelyväliaineen. Tuotamme suurimman osan proteiineistamme hyönteissoluissa (pääasiassa Drosophila S2), ja S2-solut olivat erittäneet VEGFR-3/Fc:n väliaineeseen sen jälkeen, kun metallotioneiinin promoottoria oli indusoitu 1 mM:n Cu2+-pitoisuudella noin 4,5 päivän ajan. Puhdistukseen tarkoitetun väliaineen valmistelu koostuu ainoastaan 1) solujen poistamisesta sentrifugoimalla ja 2) suodattamisesta saostumien ja muiden pienten hiukkasten poistamiseksi, jotka saattaisivat tukkia kolonnin. pH:ta ei tarvitse säätää.Nopea neutralointi matalan pH:n eluution jälkeen ON TÄRKEÄÄJuoksutimme väliaineen kertakäyttöisen 5 ml:n HiTrap-rekombinanttiproteiini A -kolonnin läpi yön noin 1 ml/min nopeudella ja eluoimme matalan pH:n puskurilla. Eluoidut 2 ml:n fraktiot neutraloitiin välittömästi 400 µl:lla 1 M Tris-liuosta (pH 8,5). Tässä vaiheessa teimme pienen virheen toisen puhdistuksen aikana. GE Healthcare ei ollut vielä tuonut markkinoille kasetteja 5 ml:n keräysputkille (eivätkä ole vieläkään tehneet niin, vaikka lupasivat ne jo syyskuuksi 2015), joten käytimme 15 ml:n Falcon-putkia 2 ml:n fraktioiden keräämiseen; niihin olimme etukäteen annostelleet 400 µl neutralointiliuosta. Sekoittuminen näissä putkissa ei kuitenkaan ollut tehokasta, ja pitkäaikainen altistuminen matalalle pH-arvolle johti proteiinimme osittaiseen vaurioitumiseen. Tämä näkyy, kun verrataan ryhmän 2 ja ryhmän 4 kokojakokromatogrammeja: Ryhmässä 4 ensimmäinen piikki (aggregaatti) on paljon suurempi ja heterogeenisempi verrattuna ryhmän 2 vastaavaan piikkiin. Itse asiassa, kun VEGFR-3/Fc eluoidaan matalalla pH:lla proteiini A -kolonneista, se saostuu aina suuremmilla pitoisuuksilla pian eluution jälkeen, mutta liukenee jälleen neutraloinnin yhteydessä. Tätä ei tapahtunut fraktioissa 5.A.3 ja 5.A.4 (ryhmä 4), koska eluaatin ja neutralointipuskurin sekoittuminen 15 ml:n Falcon-putkessa oli tehotonta (myös 2 ml:n fraktiokoko oli todennäköisesti syynä; 1 ml olisi ollut parempi). Ryhmän 2 ajon aikana poistimme putket heti ajon päätyttyä ja sekoitimme siten puskurit, kun taas ryhmän 4 osalta ajo päättyi yöllä ja eluaatti pysyi suurelta osin sekoittumattomana aamuun asti.Vaihtoehtoisesti olisimme voineet eluoida erittäin väkevällä kaootrooppisella suolalla lähes neutraalissa pH:ssa (mitä teemme seuraavalla kerralla, jos meillä on automatisoitu ajo, jossa eluointi tapahtuu keskellä yötä). Pierce tarjoaa (patentoidun) ”hellävaraisen” eluointipuskurin , jonka pH on 6,6. En tiedä Piercen puskurin koostumusta, mutta se on erittäin tiheä liuos jostakin kaootrooppisesta suolasta. 3 M kalium-/natriumtiosyanaattia tai 4 M magnesiumkloridia puskuroiduissa liuoksissa, joiden pH on noin 7, käytetään usein kaootrooppisina suoloina tähän tarkoitukseen. Hepsin Opiskelijoiden toimittamat proteiinit olivat haastavia. Ensinnäkin niiden pitoisuudet lähtöaineessa olivat hyvin alhaiset. Vaikka proteiini näkyy selvästi, kun VEGFR-3/Fc-konditionoitu elatusaine ajetaan PAGE-geelillä ja värjätään Coomassie-värillä, Hepsinille ei näy tällaista kaistaa. Lisäksi näytti siltä, että merkittävä osa proteiinista ei (enää) sisällä histagiinia, minkä vuoksi sitä ei saata talteen ensimmäisessä puhdistusvaiheessa. Se osa Hepsin-H6:sta, joka sitoutuu Ni2+-sefarosiin, eluoituu jo 20 mM:n imidatsolipitoisuudella, mikä vaikeuttaa kolonnin pesua. Hepsin, jossa on pidempi histagiini (H10), selviää 20 mM:n imidatsolipesusta, mutta sen ilmentymistasot ovat myös alhaiset. Alla on yksittäisten ajojen kromatogrammit ja merkityt kuvat Coomassie-värjätyistä PAGE-geeleistä. Äkta Avant 25:n käytön yksityiskohtainen ohje on vielä valmistumassa…

Aito Avant 25 on Michael’s Domain

FPLC-proteiinien puhdistuskurssi