Bio-Rad on Michael’s Domain

Bio-Rad korjaa NGC-laitteemme

Wed, 20 Sep 2023 00:00:00 +0000

PÄIVITYS (tilanne 21.12.2024)

Selvisimme juuri proteiinien puhdistuskurssista (ks. myös mun muut blogpostit opetuksesta ). Suoritettuamme noin 25 ajoa ”korjatulla” Bio-Rad NGC:llä joudun valitettavasti toteamaan, että suurin ongelma on edelleen olemassa: FPLC ei reagoi manuaalisesti annettuihin komentoihin. Myös näiden yhteyskatkosten satunnaisuus jatkui. Vain yhdellä opiskelijaryhmällä oli ongelmia, mutta meillä sattui useita tapauksia tuona yhtenä päivänä. Tämä päättää valitettavasti lyhyen vierailumme Bio-Radin maailmassa proteiinien puhdistuksen osalta. Kaikki tämä viittaa siihen, että lisäinvestoinnit tähän laitteeseen ovat ajanhukkaa ja rahan tuhlausta. Meillä ei ole liikaa aikaa eikä liikaa rahaa. Jos Bio-Rad haluaa tehdä jotain omasta aloitteestaan, annan mielelläni heidän tehdä mitä tahansa, jotta laite saadaan käyttökelpoiseen kuntoon, mutta emme aio aktiivisesti ryhtyä mihinkään lisätoimiin. Paras tapa pitää FPLC-laite hyvässä kunnossa on solmia huoltosopimus. Vaikka olemme viimeisten 30 vuoden aikana kahdesti saaneet yliopistoltamme rahoitusta huippuluokan FPLC-laitteen hankintaan, rahoituksen saaminen huoltosopimukseen on paljon vaikeampaa. Yksi monista syistä on se, että useimmat apurahakausit ovat lyhyempiä kuin huoltosopimukset, jotka ovat järkeviä vain, jos ne tehdään useaksi vuodeksi.

Showdown: GE Healthcaren Äkta vastaan Bio-Radin NGC

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Olen puhdistanut proteiineja vuodesta 1996 lähtien. Työskentelin Äkta Explorer -laitteella vuoteen 2015 asti, jolloin päivitimme laitteistomme Äkta Avant -malliin. Vuonna 2020 laboratoriomme muutti, ja saimme käyttöön Bio-Rad NGC -laitteen, jota olemme käyttäneet nyt kahden vuoden ajan.Bio-Rad NGC:n kanssa kohtasimme monia ongelmia. Aluksi ajattelin, että tämä saattaisi olla normaalia järjestelmänvaihdon yhteydessä. Odotin ongelmien häviävän yksi kerrallaan. Olihan meillä ollut ongelmia myös silloin, kun vaihdoimme Explorerista Avant-laitteeseen.Kuitenkin kahden vuoden ja kymmenien puhdistuskierrosten jälkeenkin NGC:n ongelmat eivät näytä loppuvan. Aina kun ratkaisemme yhden ongelman, ilmestyy uusi, aiemmin tuntematon ongelma. Ja toisin kuin GE Healthcare, Bio-Radin asiakaspalvelu ei ole lähelläkään sitä, mitä olemme kokeneet GE Healthcaren kanssa. Kun IT-osastomme ei saanut Äktaa kytkettyä yliopistomme verkkoon, GE Healthcare lähetti Münchenin tiimistään insinöörin Helsinkiin korjaamaan ongelman. GE Healthcare arvosti oppimiskäyräämme ja tarjosi lisäksi jollekin tiimimme jäsenelle ilmaisen osallistumisen yhteen kursseistaan. Eikä heidän tukensa rajoittunut takuuaikaan! He todella halusivat meidän olevan tyytyväisiä laitteeseensa. Emme koe saavamme yhtä paljon tukea Bio-Radilta. Tuntuu aina siltä, että meidän on pakotettava heidät ratkaisemaan NGC:n kanssa kohtaamamme ongelmat, ja heidän vasteaikansa on selvästi alle asiakkaiden odotusten.Tämä on ensimmäinen useista blogikirjoituksista, joissa verrataan Äktaa ja NGC:tä. Toivon, että löydän aikaa kirjoittaa tarkemmin kaikista ongelmistamme seuraavien kuukausien aikana.Päätimme vuonna 2015, että tarvitsimme vihdoin uuden FPLC:n. Äkta Explorer -laitteemme oli tulossa käyttöikänsä päähän, ja olimme saaneet noin 100 000 rahoitusta keskuslaitoksemme FPLC:n uusimiseen. Laite oli niin kallis, että meidän piti käydä läpi virallinen tarjouskilpailumenettely (tuolloin raja oli 30 000 €, mutta se on sittemmin nostettu 60 000 €:ksi). Kilpailijoita oli vain kaksi: Bio-Rad Discover NGC ja GE Healthcare Äkta Avant. Bio-Rad oli halvempi (82 810 € verrattuna 95 470 €), mutta päätimme ostaa GE Healthcaren laitteen. Yksi tärkeä syy oli se, että kaikki käyttäjämme olivat tottuneet käyttämään Äkta Exploreria ja sen Unicorn-ohjelmistoa. Vaihtaminen olisi yksinkertaisesti häiritsevää ja vaatisi meiltä paljon tukea ja aikaa. Oli kuitenkin myös teknisiä syitä, joiden vuoksi pidimme Äktaa parempana kuin NGC:tä: Äkta Avantin edut

Arvostelu GE Healthcaren Äkta Avant 25 -laitteesta

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Noin vuosi sitten saimme rahoitusta tiedekunnan sisäisessä hakukierroksessa vanhan Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC -laitteen Proteiinituotannon ja -puhdistuksen yhteislaitoksessa . Äkta Explorer oli hankittu vuonna 1996(?), kun ruotsalainen tuotemerkki Pharmacia oli vielä olemassa. Vuonna 2014 pahin mahdollinen skenaario toteutui, ja sekä monokromaattori että ksenon-salamalamput rikkoutuivat lähes samanaikaisesti, mikä aiheutti meille lähes 10 000 euron laskun. Siksi halusimme korvata laitteen nykyaikaisemmalla mallilla. Tällä alalla on vain kaksi yritystä, jotka tarjoavat luotettavia laitteita: GE Healthcare ( Äkta-tuotelinja ) ja BioRad ( NGC-tuotelinja ). GE Healthcare peri Äkta-tuotemerkin Pharmacialta useiden fuusioiden kautta, kun taas BioRad on suhteellisen uusi kilpailija NGC-malleillaan, jotka se toi markkinoille vasta muutama vuosi sitten.Päätimme valita Äkta Avant 25 . Halusimme ehdottomasti koteloidun, jäähdytetyn fraktiokerääjän. Halusimme myös tutun käyttökokemuksen. Suoritamme usein automatisoituja puhdistuksia, emmekä halua proteiinejamme olevan pitkiä aikoja huoneenlämmössä avoimissa putkissa, joihin bakteerit ja ilmasta tuleva pöly voivat päästä. Tähän mennessä olemme käyttäneet Äkta Avantia noin puoli vuotta, ja meillä on jo hyvä käsitys siitä, miten se vertautuu Äkta Exploreriin. Vaikka Avant on modernimpi kuin Explorer, kaikki ydinlaitoksemme käyttäjät käyttävät edelleen Exploreria. He ovat tottuneet Unicorn 5.11:n käyttöliittymään eivätkä näytä olevan kiinnostuneita oppimaan Avantin – myönnettäköön – monimutkaisempaa käyttöliittymää. Toinen syy siihen, että laitetta on toistaiseksi käytetty vain sisäisesti, oli kuitenkin se, että olemme kohdanneet melkoisen määrän ongelmia. Vanhan Äkta Explorer -laitteemme kanssa emme ole koskaan kohdanneet niin monia ongelmia niin lyhyessä ajassa peräkkäin. En tiedä, onko tilanteemme tyypillinen (GE Healthcaren edustajien mukaan se ei ole). Siitä huolimatta tässä ovat ongelmat, joita olemme kohdanneet:

Neon-elektroporaatiolaite pettää

Tue, 04 Aug 2015 00:00:00 +0000

PÄIVITYS: Emme ole ainoita, jotka pyrkivät säästämään toimintakustannuksissaan. Tämä laboratorio julkaisi Neon-järjestelmällä tekemänsä kokeet lehdessä Analytic Biochemistry . Kiitos Joachim Goedhartille ( @joachimgoedhart ), joka toi tämän tietoon! Neon-transfektiolaite valmistajalta Life Technologies (oho, nykyään Thermo Fischer ja aiemmin Invitrogen ) tuotiin markkinoille noin viisi vuotta sitten. Se on suunniteltu nisäkässolujen helppoon elektroporointiin. Laite on ollut käytössämme vuodesta 2011 lähtien, mutta sitä ei ole juurikaan käytetty. En tiedä, johtuuko laitteen vähäinen käyttö sen käyttäjäepäystävällisyydestä (en vieläkään osaa kiinnittää elektrodin kärkeä pipettiin, vaikka olen tehnyt tämän satoja kertoja, mekaniikka on vain todella hankalaa), kalliista käyttökustannuksista (kertakäyttöisistä kullatuista elektrodeista ja valmistajan omasta transfektiopuskurista) vai jostakin muusta, jota en osaa selvittää. Haluaisin kuitenkin jakaa muutaman asian, sillä verkosta löytyy vain vähän todella hyödyllistä tietoa Neon-laitteesta.Ensimmäinen asia, josta meillä oli jatkuvasti ongelmia, olivat elektrodikärjessä olevat ilmakuplat, jotka johtavat katastrofaalisesti alhaiseen elektroporointitehokkuuteen. Ainoa tapa todella estää tämä on valmistaa vähintään 25 % enemmän solususpensiota kuin mitä tosiasiassa tarvitaan. Jos valmistat vain 10 % enemmän, viimeisessä elektroporoinnissa syntyy varmasti kipinöintiä väistämättömien ilmakuplien vuoksi (solususpensio tarttuu lisäksi helposti pipetin kärjen ulkopintaan, mikä lisää tarvetta valmistaa enemmän kuin todellisuudessa tarvitaan). Tämän seurauksena elektroporointipuskuri R loppui meiltä kauan ennen kuin pipetin kärjet loppuivat. Lisäksi puskuria R ei voi ostaa erikseen. Life Technologiesin edustaja, jonka kanssa olin yhteydessä, lupasi lähettää meille pienen erän pipetin kärkiä ja puskuria hyvän tahdon eleenä (se oli tammikuussa), mutta odotamme yhä niiden saapumista…Valitettavasti vanha Gene Pulser II -elektroporaatiolaite rikkoutui äskettäin. Bio-Rad ei enää korjaa sitä eikä myöskään toimita varaosia. Sitä käytettiin pääasiassa E. coli:n elektroporointiin. Tiesin, että Neon-laitetta ei ole suunniteltu E. coli:n elektroporointiin. Miksi ei, ja miksi sitä ei voi käyttää tähän tarkoitukseen? Kävi ilmi, että sähkökentän voimakkuus ei riitä läheskään E. coli:lle (BioRad Gene Pulser II:ssa tyypillisessä bakteerien elektroporoinnissa saavutetaan 12,5 kV/cm:n sähkökenttä, kun taas Neon saavuttaa hädin tuskin noin 850 V/cm). Kuitenkin (ajattelin), Neon pystyy tuottamaan paljon pidempiä pulsseja kuin Gene Pulser II (Neonin mainostetaan pystyvän tuottamaan jopa 100 ms:n pulsseja, kun taas Gene Pulser II:n tyypillinen pulssin pituus on noin 5 ms). Tämän lisäksi Neon pystyy lähettämään automaattisesti useita pulsseja. Halusin siis testata, voiko pitkä ja/tai toistuva pulssi, jonka kenttävoimakkuus on pienempi, transfektoida E. coli -bakteeria. Kävi kuitenkin ilmi, että kun E. coli:n transfektiopuskurina käytetään vettä (tai 10-prosenttista glyserolia) – kuten yleensä tehdään – laite ilmoittaa, ettei kärkielektrodi ole kosketuksessa. Tämä johtuu siitä, että laite tarkistaa, onko kärki asetettu oikein, lähettämällä pienen virran järjestelmän läpi, eikä virta kulje, jos E. coli on suspendoitu veteen. Jotta laite ”hyväksyisi” asetetun pipetin kärkielektrodin, tarvitaan 10–20 mM NaCl:ää. Käytin siis 15 mM natriumkloridia E. coli:n elektroporointipuskurina ja asetin elektroporointiparametrit arvoihin 2500 V ja 100 ms. Yllätys: Laite kieltäytyy antamasta tällaista pulssia, koska se on ”tehorajan yläpuolella!”. Suurin pulssin kesto, jonka se voi tuottaa 2500 V:n jännitteellä, on 19 ms. Valitettavasti edes tätä pulssia ei voida antaa automaattisesti useita kertoja (jälleen: ”tehorajan yläpuolella!”). Siksi suoritin tämän pulssin manuaalisesti 1–20 kertaa, mutta yksikään bakteeri ei saanut DNA:ta ja kaikki bakteerilevyt jäivät tyhjiksi. Käyttöohjeessa todetaan: `”Neon TM -laite on suunniteltu hyväksymään vain tiettyjä arvoja, ja kunkin arvon raja-arvot on lueteltu alla. Jos syöttämäsi arvo ylittää enimmäisarvon, näyttöön tulee virheilmoitus. Syöttöjännitealue: 500–2 500 V. Syöttöpulssin leveysalue: 1–100 ms. Syöttöpulssien lukumääräalue: 1–10.” Valitettavasti tämä voidaan ymmärtää hyvin helposti väärin. Minulle ei ollut selvää, ettei näiden alueiden sisällä olevia kolmea parametria voi yhdistellä vapaasti. Luulisi, että Life Technologylla olisi parempia teknisiä kirjoittajia (mutta ehkä he eivät käytä laitetta…). Johtopäätös: Laite on täysin käyttökelvoton mihinkään muuhun kuin nisäkässoluihin. Myös jotkut muut mielenkiintoiset sovellukset (kuten sukkulamatojen tai muiden pienten eliöiden elektroporaatio) ovat vaikeita tai mahdottomia. Vaikka laite saattaa olla hyvä valinta monille nisäkässoluille, se on paljon rajoitetumpi kuin vanhanaikainen BioRad Gene Pulser II. P.S.: Käytin puskuria E pipettiaseman täyttämiseen (käytettäväksi 10 µl:n kärkien kanssa). Testasin kuitenkin puskurin E sijaan myös seosta, jossa oli 90 % 150 mM natriumkloridia ja 10 % glyserolia (joka antaa saman johtavuuden kuin puskuri E). Haluaisin kuitenkin edelleen todella tietää puskurin R koostumuksen. Miksi? Koska uskon, että kärkielektrodeja voidaan kierrättää useammin kuin vain kaksi kertaa (muut pipettikärkielektrodien valmistajat mainostavat, että heidän elektrodejaan voidaan kierrättää paljon useammin (esim. BactoZapper , vaikka hekään eivät anna tarkkoja lukuja). Neonin käyttöohjeessa todetaan, että ”jos kärkiä käytetään useammin kuin kaksi kertaa, männän pinnalle voi muodostua oksidia, mikä heikentää männän elektrodin toimintaa”. Elektrodi on kullattu, ja kullan pitäisi kestää oksidien muodostumista paremmin kuin BactoZapperin ruostumattomasta teräksestä valmistetut elektrodit…