E. Coli on Michael’s Domain

E. colista peräisin oleva bioaktiivinen VEGF-C ilman in vitro -taitumista!

Fri, 28 Oct 2022 00:00:00 +0000

Artikkelimme ”Bioaktiivinen VEGF-C E. colista” on julkaistu Scientific Reports -lehdessä. Lue täältä: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22960-0.As Itse asiassa tein ensimmäiset kokeet, joissa ilmentin VEGF-C:tä E. colissa vuonna 1999, mutta en koskaan saanut aktiivista proteiinia. Seuraavien yli 15 vuoden ajan käytimme VEGF-C:n tuottamiseen yksinomaan eukaryoottisoluja (hiivaa, S2/Sf9/Hi5-hyönteissoluja, CHO-soluja). Elvytimme ”VEGF-C E. coli:ssa” -projektin muutama vuosi sitten ja saavutimme lopulta tavoitteemme viime vuonna. Työmäärä oli kuitenkin paljon suurempi kuin alun perin olimme arvioineet. Alussa kaikki yritykset epäonnistuivat, ja pelastaaksemme projektin kehitimme in vitro -taitto-ohjeiston. Oli ehkä enemmän onnea kuin osaamista, että törmäsimme liukoisuustunnisteen ja redox-modifioidun E. coli-kannan yhdistelmään, jolla onnistui tuottaa suoraan bioaktiivista VEGF-C:tä ilman in vitro -taitto-vaihetta. Päätimme sisällyttää tulososioon myös epäonnistuneet yrityksemme (CyDisCo ja periplasmainen ilmentyminen) välttääksemme ”file drawer effect” -ilmiön.

”E. colin sytoplasmasta peräisin oleva bioaktiivinen VEGF-C” – ennakkopainos verkossa

Fri, 01 Jul 2022 00:00:00 +0000

Manuskriptimme ennakkopainos on julkaistu verkossa. Esitämme, kuinka bioaktiivista kypsää VEGF-C:tä voidaan tuottaa E. coli -bakteerin sytoplasmassa ilman, että tarvitaan proteiinin taitumisvaihetta. Kesti melko kauan, ennen kuin pääsimme tähän tulokseen, ja kokeilimme monia menetelmiä, jotka eivät toimineet, ennen kuin löysimme toimivan tavan. Kuvaamme myös ne menetelmät, jotka epäonnistuivat. Näyttää siltä, että VEGF-C:ssä on yksinkertaisesti liian monta kysteiinijäännöstä, joiden kaikkien on muodostettava pareja oikeassa konfiguraatiossa. Samassa käsikirjoituksessa esittelemme myös toimivan uudelleenlaskostusmenetelmän. Katsokaa sitä ja antakaa meille palautetta: https://www.researchsquare.com/article/rs-1776636/v1 .

Neon-elektroporaatiolaite pettää

Tue, 04 Aug 2015 00:00:00 +0000

PÄIVITYS: Emme ole ainoita, jotka pyrkivät säästämään toimintakustannuksissaan. Tämä laboratorio julkaisi Neon-järjestelmällä tekemänsä kokeet lehdessä Analytic Biochemistry . Kiitos Joachim Goedhartille ( @joachimgoedhart ), joka toi tämän tietoon! Neon-transfektiolaite valmistajalta Life Technologies (oho, nykyään Thermo Fischer ja aiemmin Invitrogen ) tuotiin markkinoille noin viisi vuotta sitten. Se on suunniteltu nisäkässolujen helppoon elektroporointiin. Laite on ollut käytössämme vuodesta 2011 lähtien, mutta sitä ei ole juurikaan käytetty. En tiedä, johtuuko laitteen vähäinen käyttö sen käyttäjäepäystävällisyydestä (en vieläkään osaa kiinnittää elektrodin kärkeä pipettiin, vaikka olen tehnyt tämän satoja kertoja, mekaniikka on vain todella hankalaa), kalliista käyttökustannuksista (kertakäyttöisistä kullatuista elektrodeista ja valmistajan omasta transfektiopuskurista) vai jostakin muusta, jota en osaa selvittää. Haluaisin kuitenkin jakaa muutaman asian, sillä verkosta löytyy vain vähän todella hyödyllistä tietoa Neon-laitteesta.Ensimmäinen asia, josta meillä oli jatkuvasti ongelmia, olivat elektrodikärjessä olevat ilmakuplat, jotka johtavat katastrofaalisesti alhaiseen elektroporointitehokkuuteen. Ainoa tapa todella estää tämä on valmistaa vähintään 25 % enemmän solususpensiota kuin mitä tosiasiassa tarvitaan. Jos valmistat vain 10 % enemmän, viimeisessä elektroporoinnissa syntyy varmasti kipinöintiä väistämättömien ilmakuplien vuoksi (solususpensio tarttuu lisäksi helposti pipetin kärjen ulkopintaan, mikä lisää tarvetta valmistaa enemmän kuin todellisuudessa tarvitaan). Tämän seurauksena elektroporointipuskuri R loppui meiltä kauan ennen kuin pipetin kärjet loppuivat. Lisäksi puskuria R ei voi ostaa erikseen. Life Technologiesin edustaja, jonka kanssa olin yhteydessä, lupasi lähettää meille pienen erän pipetin kärkiä ja puskuria hyvän tahdon eleenä (se oli tammikuussa), mutta odotamme yhä niiden saapumista…Valitettavasti vanha Gene Pulser II -elektroporaatiolaite rikkoutui äskettäin. Bio-Rad ei enää korjaa sitä eikä myöskään toimita varaosia. Sitä käytettiin pääasiassa E. coli:n elektroporointiin. Tiesin, että Neon-laitetta ei ole suunniteltu E. coli:n elektroporointiin. Miksi ei, ja miksi sitä ei voi käyttää tähän tarkoitukseen? Kävi ilmi, että sähkökentän voimakkuus ei riitä läheskään E. coli:lle (BioRad Gene Pulser II:ssa tyypillisessä bakteerien elektroporoinnissa saavutetaan 12,5 kV/cm:n sähkökenttä, kun taas Neon saavuttaa hädin tuskin noin 850 V/cm). Kuitenkin (ajattelin), Neon pystyy tuottamaan paljon pidempiä pulsseja kuin Gene Pulser II (Neonin mainostetaan pystyvän tuottamaan jopa 100 ms:n pulsseja, kun taas Gene Pulser II:n tyypillinen pulssin pituus on noin 5 ms). Tämän lisäksi Neon pystyy lähettämään automaattisesti useita pulsseja. Halusin siis testata, voiko pitkä ja/tai toistuva pulssi, jonka kenttävoimakkuus on pienempi, transfektoida E. coli -bakteeria. Kävi kuitenkin ilmi, että kun E. coli:n transfektiopuskurina käytetään vettä (tai 10-prosenttista glyserolia) – kuten yleensä tehdään – laite ilmoittaa, ettei kärkielektrodi ole kosketuksessa. Tämä johtuu siitä, että laite tarkistaa, onko kärki asetettu oikein, lähettämällä pienen virran järjestelmän läpi, eikä virta kulje, jos E. coli on suspendoitu veteen. Jotta laite ”hyväksyisi” asetetun pipetin kärkielektrodin, tarvitaan 10–20 mM NaCl:ää. Käytin siis 15 mM natriumkloridia E. coli:n elektroporointipuskurina ja asetin elektroporointiparametrit arvoihin 2500 V ja 100 ms. Yllätys: Laite kieltäytyy antamasta tällaista pulssia, koska se on ”tehorajan yläpuolella!”. Suurin pulssin kesto, jonka se voi tuottaa 2500 V:n jännitteellä, on 19 ms. Valitettavasti edes tätä pulssia ei voida antaa automaattisesti useita kertoja (jälleen: ”tehorajan yläpuolella!”). Siksi suoritin tämän pulssin manuaalisesti 1–20 kertaa, mutta yksikään bakteeri ei saanut DNA:ta ja kaikki bakteerilevyt jäivät tyhjiksi. Käyttöohjeessa todetaan: `”Neon TM -laite on suunniteltu hyväksymään vain tiettyjä arvoja, ja kunkin arvon raja-arvot on lueteltu alla. Jos syöttämäsi arvo ylittää enimmäisarvon, näyttöön tulee virheilmoitus. Syöttöjännitealue: 500–2 500 V. Syöttöpulssin leveysalue: 1–100 ms. Syöttöpulssien lukumääräalue: 1–10.” Valitettavasti tämä voidaan ymmärtää hyvin helposti väärin. Minulle ei ollut selvää, ettei näiden alueiden sisällä olevia kolmea parametria voi yhdistellä vapaasti. Luulisi, että Life Technologylla olisi parempia teknisiä kirjoittajia (mutta ehkä he eivät käytä laitetta…). Johtopäätös: Laite on täysin käyttökelvoton mihinkään muuhun kuin nisäkässoluihin. Myös jotkut muut mielenkiintoiset sovellukset (kuten sukkulamatojen tai muiden pienten eliöiden elektroporaatio) ovat vaikeita tai mahdottomia. Vaikka laite saattaa olla hyvä valinta monille nisäkässoluille, se on paljon rajoitetumpi kuin vanhanaikainen BioRad Gene Pulser II. P.S.: Käytin puskuria E pipettiaseman täyttämiseen (käytettäväksi 10 µl:n kärkien kanssa). Testasin kuitenkin puskurin E sijaan myös seosta, jossa oli 90 % 150 mM natriumkloridia ja 10 % glyserolia (joka antaa saman johtavuuden kuin puskuri E). Haluaisin kuitenkin edelleen todella tietää puskurin R koostumuksen. Miksi? Koska uskon, että kärkielektrodeja voidaan kierrättää useammin kuin vain kaksi kertaa (muut pipettikärkielektrodien valmistajat mainostavat, että heidän elektrodejaan voidaan kierrättää paljon useammin (esim. BactoZapper , vaikka hekään eivät anna tarkkoja lukuja). Neonin käyttöohjeessa todetaan, että ”jos kärkiä käytetään useammin kuin kaksi kertaa, männän pinnalle voi muodostua oksidia, mikä heikentää männän elektrodin toimintaa”. Elektrodi on kullattu, ja kullan pitäisi kestää oksidien muodostumista paremmin kuin BactoZapperin ruostumattomasta teräksestä valmistetut elektrodit…

Streptomysiinin ja spektinomysiinin vastustuskyky

Sun, 11 Jan 2015 00:00:00 +0000

Monet ORFeome-geenikokoelman cDNA-kloonit toimitetaan pENTR223.1-plasmidissa*. Näiden kloonien viljelyyn useimmat käyttävät spektinomysiiniä, koska niin antibioottiresistenssigeeni on nimetty ORFeome-yhteistyön kartoissa ja koska protokolla sitä edellyttää. Kirjallisuutta tarkemmin tarkasteltaessa käy kuitenkin ilmi, että sama valintamarkkeri toimisi yhtä hyvin myös streptomysiinillä. No, mikä on ero? Pääasiassa hinta: kun 5 grammaa Sigma-valmistajan spektinomysiiniä maksaa täällä Suomessa 112,7 € (Sigma 85555-5G) , sama määrä streptomysiiniä maksaa vain 17,80 €, eli se on yli kuusi kertaa halvempaa (Sigma S6501-5G) .pENTR223.1:n resistenssigeeni on aminoglykosidi-adenyylitransferaasigeeni aadA (streptomysiini 3’’(9)-O-nukleotidyylitransferaasi; aminoglykosidi 3"-adenyylitransferaasi (AAD(3”)(9); ANT(3”)(9)), joka antaa resistenssin sekä spektinomysiinille että streptomysiinille. On kuitenkin olemassa samankaltaisia aminoglykosidi-adenyylitransferaaseja, jotka eivät anna resistenssiä molemmille antibiooteille, vaan vain jommallekummalle. Siksi sinun on tiedettävä tarkalleen, mitä spektinomysiiniresistenssigeeniä plasmidi kantaa, jos haluat korvata spektinomysiinin halvemmalla streptomysiinillä. Plasmidikartat eivät useinkaan ole avuksi: olen nähnyt, että pENTR223.1:ssä oleva aadA-geeni on merkitty SmR:llä (streptomysiiniresistenssi, kuten SnapGenessä) tai SpnR:llä (spektinomysiiniresistenssi, kuten ORFeome-kokoelman kartoissa).Testatakseni kokeellisesti, vahvistaako pENTR223.1 resistenssin molemmille antibiooteille, viljelin insertin sisältävää pENTR223.1-plasmidia 100 µg/ml:n spektinomysiini- ja 100 µg/ml:n streptomysiinipitoisuudessa, ja se kasvoi hyvin molemmissa olosuhteissa, kun taas transformoimaton emokanta E. coli (NEB5-alpha) ei kasvanut kummassakaan. Erot eivät kuitenkaan ole aina selkeitä, kun tarkastellaan näiden antibioottien eri pitoisuuksia. Streptomysiiniä/spektinomysiiniä inaktivoivat aminoglykosidi-adenyylitransferaasit ovat substraattispesifisiä, mutta eivät yksinomaan. Tämä tarkoittaa, että jonkin verran resistenssiä matalalle streptomysiinipitoisuudelle voi johtua aminoglykosidi-adenyylitransferaasista, joka kohdistuu ensisijaisesti spektinomysiiniin (tai päinvastoin). Käytännössä jotkut niistä ovat kuitenkin riittävän eksklusiivisia, jotta ne voidaan luokitella joko SmR- tai SpnR-tyyppisiksi. Jos haluat tietää, voit aina kokeilla sitä… Toinen asia, jonka opin tätä tehdessäni, on se, että negatiivinen valintamarkkeri ccdB EI TOIMI XL1 Blue -kannassa, kun taas se toimii NEB5-alpha-kannassa. Ilmeisesti ccdB ei toimi myöskään DH5alpha- ja JM109-kannoissa (mikä ero on DH5alpha- ja NEB5alpha-kannoilla?).* pENTR-223.1:tä kutsutaan myös nimillä pDONR-223.1 tai pENTR223.1-Sfi, koska inserttiä reunustavat kaksi SfiI-kohtaa. Ihmiset kutsuvat plasmidiä yleensä pDONR:ksi ennen cDNA:n lisäämistä ja pENTR:ksi, jos plasmidi sisältää cDNA:n. Tämä käyttötapa ei kuitenkaan ole yleispätevä. Insertin lisäämisen jälkeen (Gateway BP -reaktiolla) pDONR223.1-vektori menettää ccdB- ja chlR/CmR-selektiomarkkerit, ja tuloksena olevaa runkoa kutsutaan useimmiten nimellä pENTR223.1.