FPLC on Michael’s Domain

Bio-Rad korjaa NGC-laitteemme

Wed, 20 Sep 2023 00:00:00 +0000

PÄIVITYS (tilanne 21.12.2024)

Selvisimme juuri proteiinien puhdistuskurssista (ks. myös mun muut blogpostit opetuksesta ). Suoritettuamme noin 25 ajoa ”korjatulla” Bio-Rad NGC:llä joudun valitettavasti toteamaan, että suurin ongelma on edelleen olemassa: FPLC ei reagoi manuaalisesti annettuihin komentoihin. Myös näiden yhteyskatkosten satunnaisuus jatkui. Vain yhdellä opiskelijaryhmällä oli ongelmia, mutta meillä sattui useita tapauksia tuona yhtenä päivänä. Tämä päättää valitettavasti lyhyen vierailumme Bio-Radin maailmassa proteiinien puhdistuksen osalta. Kaikki tämä viittaa siihen, että lisäinvestoinnit tähän laitteeseen ovat ajanhukkaa ja rahan tuhlausta. Meillä ei ole liikaa aikaa eikä liikaa rahaa. Jos Bio-Rad haluaa tehdä jotain omasta aloitteestaan, annan mielelläni heidän tehdä mitä tahansa, jotta laite saadaan käyttökelpoiseen kuntoon, mutta emme aio aktiivisesti ryhtyä mihinkään lisätoimiin. Paras tapa pitää FPLC-laite hyvässä kunnossa on solmia huoltosopimus. Vaikka olemme viimeisten 30 vuoden aikana kahdesti saaneet yliopistoltamme rahoitusta huippuluokan FPLC-laitteen hankintaan, rahoituksen saaminen huoltosopimukseen on paljon vaikeampaa. Yksi monista syistä on se, että useimmat apurahakausit ovat lyhyempiä kuin huoltosopimukset, jotka ovat järkeviä vain, jos ne tehdään useaksi vuodeksi.

Showdown: GE Healthcaren Äkta vastaan Bio-Radin NGC

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Olen puhdistanut proteiineja vuodesta 1996 lähtien. Työskentelin Äkta Explorer -laitteella vuoteen 2015 asti, jolloin päivitimme laitteistomme Äkta Avant -malliin. Vuonna 2020 laboratoriomme muutti, ja saimme käyttöön Bio-Rad NGC -laitteen, jota olemme käyttäneet nyt kahden vuoden ajan.Bio-Rad NGC:n kanssa kohtasimme monia ongelmia. Aluksi ajattelin, että tämä saattaisi olla normaalia järjestelmänvaihdon yhteydessä. Odotin ongelmien häviävän yksi kerrallaan. Olihan meillä ollut ongelmia myös silloin, kun vaihdoimme Explorerista Avant-laitteeseen.Kuitenkin kahden vuoden ja kymmenien puhdistuskierrosten jälkeenkin NGC:n ongelmat eivät näytä loppuvan. Aina kun ratkaisemme yhden ongelman, ilmestyy uusi, aiemmin tuntematon ongelma. Ja toisin kuin GE Healthcare, Bio-Radin asiakaspalvelu ei ole lähelläkään sitä, mitä olemme kokeneet GE Healthcaren kanssa. Kun IT-osastomme ei saanut Äktaa kytkettyä yliopistomme verkkoon, GE Healthcare lähetti Münchenin tiimistään insinöörin Helsinkiin korjaamaan ongelman. GE Healthcare arvosti oppimiskäyräämme ja tarjosi lisäksi jollekin tiimimme jäsenelle ilmaisen osallistumisen yhteen kursseistaan. Eikä heidän tukensa rajoittunut takuuaikaan! He todella halusivat meidän olevan tyytyväisiä laitteeseensa. Emme koe saavamme yhtä paljon tukea Bio-Radilta. Tuntuu aina siltä, että meidän on pakotettava heidät ratkaisemaan NGC:n kanssa kohtaamamme ongelmat, ja heidän vasteaikansa on selvästi alle asiakkaiden odotusten.Tämä on ensimmäinen useista blogikirjoituksista, joissa verrataan Äktaa ja NGC:tä. Toivon, että löydän aikaa kirjoittaa tarkemmin kaikista ongelmistamme seuraavien kuukausien aikana.Päätimme vuonna 2015, että tarvitsimme vihdoin uuden FPLC:n. Äkta Explorer -laitteemme oli tulossa käyttöikänsä päähän, ja olimme saaneet noin 100 000 rahoitusta keskuslaitoksemme FPLC:n uusimiseen. Laite oli niin kallis, että meidän piti käydä läpi virallinen tarjouskilpailumenettely (tuolloin raja oli 30 000 €, mutta se on sittemmin nostettu 60 000 €:ksi). Kilpailijoita oli vain kaksi: Bio-Rad Discover NGC ja GE Healthcare Äkta Avant. Bio-Rad oli halvempi (82 810 € verrattuna 95 470 €), mutta päätimme ostaa GE Healthcaren laitteen. Yksi tärkeä syy oli se, että kaikki käyttäjämme olivat tottuneet käyttämään Äkta Exploreria ja sen Unicorn-ohjelmistoa. Vaihtaminen olisi yksinkertaisesti häiritsevää ja vaatisi meiltä paljon tukea ja aikaa. Oli kuitenkin myös teknisiä syitä, joiden vuoksi pidimme Äktaa parempana kuin NGC:tä: Äkta Avantin edut

GE:n Äkta Avant -ohjelmiston päivittäminen Windows 10:een

Tue, 18 Feb 2020 00:00:00 +0000

Avant on GE Healthcaren Äkta-sarjan FPLC (nopea proteiinien nestekromatografia) -laitteiden lippulaiva. Käytämme sitä säännöllisesti, ja se on kaikkien käytettävissä Helsingin yliopistossa.Yliopistomme päätti toimia yhteistyössä Microsoftin kanssa ja estää kaiken verkkoliikenteen Windows 7 -tietokoneilta. Koska Äkta-laitettamme (ostettu vuonna 2015) käyttävät monet eri tutkijat, käytämme Microsoftin Active Directorya käyttäjien tunnistamiseen ja laitteen käytön seurantaan. Kun yliopisto lopulta sulki Windows 7 -liikenteen tammikuun lopussa, päivitimme lopulta HP-tietokoneen Windows 7:stä Windows 10:een . Ennen päivitystä otimme yhteyttä GE:hen varmistaaksemme, että FPLC toimisi. Vaikka yliopistomme käyttämän Windows 10:n rakennusnumero (Windows 10 Enterprise, versio 1809, rakennusnumero 17763.1039), ei ollut tuettu missään GE:n vuosien varrella julkaisemassa Unicorn 7 -versiossa (katso tämä ohjelmistoyhteensopivuustaulukko, jota en enää löydä GE:n verkkosivuilta: https://drive.google.com/open?id=1cA33lEqfEr0MIaA8r9TyoQFcxiHWuZsp) , meille vakuutettiin, että ohjelmisto toimisi edelleen. Valitettavasti tämä ei pitänyt paikkaansa.**Paikallinen päivitys vai puhdas asennus?**Teimme Win7:stä Win10:een paikallisen päivityksen. En ole koskaan pitänyt näistä. Edes hieman paremmilla käyttöjärjestelmillä, kuten macOS ja Linux , paikan päällä tehtävät päivitykset eivät ole aina sujuneet ongelmitta. Uusi asennus on aina ollut turvallisempi (ja myös nopeampi) vaihtoehto.YhteysongelmatPäivityksen jälkeen Unicorn 7 alkoi menettää yhteyden Äkta Avant -laitteeseen käynnissä olevien proteiinipuhdistusajojen aikana. Manuaalisissa ajoissa voimme selvästi havaita, että tietyt komennot laukaisivat yhteyden katkeamisen. Äktan LCD-näyttö pimeni ja laite käynnistyi uudelleen. Luonnollisesti epäilimme, että tämä johtui Windows 10:een tehdystä päivityksestä. Koska Unicorn 7.0.2:ta ei ollut testattu toimimaan meidän Windows 10 -versiomme kanssa, halusimme ensin yrittää päivittää Unicorn 7:n versioon, joka oli testattu meidän Win10-versiomme kanssa. Olin jo joulukuussa pyytänyt kyseistä päivitystä GE:ltä, mutta pyyntöni oli jätetty huomiotta, ja minulla oli tuolloin paljon muuta tekemistä, joten en vaivautunut palaamaan asiaan (jälkikäteen ajateltuna suuri virhe).OhjelmistopäivityksetSe, mitä Chrome ja Firefox tekevät viikoittain hiljaa taustalla (käyttäjän huomaamatta), vaatii GE:n tapauksessa käyttäjältä lähes kahden viikon täysipäiväisen panostuksen. Yksinkertainen lataus saattaisi toimia Bio-Rad , mutta GE vaatii monimutkaista, sekavaa, epäselvää, käyttäjäepäystävällistä, jatkuvasti muuttuvaa ja GDPR-säännösten vastaista järjestelmää, joka lisäksi sijaitsee palvelimilla, jotka tuntuvat niin hitailta, että ihmettelee jatkuvasti, onko selainvälilehti jumiutunut. Mitä siihen sanottavaa, GE:n verkkosivut ovat aina olleet tällaisia huolimatta lukuisista uudistuksista ja GE:n digitaalisesta muutoksesta. Minun ja erilaisten GE:n tukiosoitteiden välinen sähköpostiketju käsittää tänään 60 sähköpostia (alkaen ensimmäisestä tukipyynnöstäni 2. joulukuuta 2019). Tämän lisäksi on käyty myös melko paljon puhelinkeskusteluja (koska sähköpostia näyttää usein pidettävän oletuksena ”ei-kiireellisenä”).Tietosuojaan liittyvät huolenaiheet GE:n asiakastietojen käsittelystäKun olin tehnyt lataustilauksen, saanut tarjouksen, vahvistanut tilauksen ja saanut tilausvahvistuksen, sain vihdoin ”luvan” ladata Unicornin uusimman version (eli 7.5). Kirjauduin GE:n ”eDeliveryPortaliin” vain huomatakseni, että pystyin näkemään monien muiden GE-asiakkaiden ohjelmistokäyttöoikeudet ja lataukset, mutta en yhtään omaani. Jonkin verran edestakaisin viestittelyn jälkeen versio 7.5 ilmestyi vihdoin latausluettelooni. Lisenssini puuttuu edelleen tänäkin päivänä. Mutta miksi vaivautua? Voisin käyttää mitä tahansa muuta lisenssiä (väärennettyäni tietokoneeni MAC-osoitteen, sillä ohjelmisto on ilmeisesti sidottu tiettyyn tietokoneeseen sen verkkokortin MAC-osoitteen kautta). Tämä on selvä GDPR:n rikkomus, sillä ei ole mitään syytä, miksi tietoni (käyttöoikeustunnukset, MAC-osoitteet, nimet, sähköpostiosoitteet) pitäisi olla muiden asiakkaiden saatavilla. Voi olla, että GE pitää Helsingin yliopistoa yhtenä asiakkaana; se olisi jo suunnittelultaan GDPR:n vastaista.Järjestelmän konfiguraatiotiedostojen (eli laiteohjelmiston) etsiminenEmme kuitenkaan olleet päivittäneet järjestelmän konfiguraatiotiedostoja, koska en ollut löytänyt niitä GE LifeSciencen verkkosivuilta . Käytössämme oli versio 3, kun taas uusin versio oli 3.6. Huomionarvoista on, että nämä tiedostot sisältävät myös yksittäisten Äkta-komponenttien laiteohjelmiston. Näyttää siltä, että tämä latauslinkki on piilotettu huolellisesti. Tarvitsin GE:n apua sen löytämiseksi. GE LifeScience -verkkosivustolla on hakutoiminto, ja haku jopa löytää kyseisen lataustiedoston. Se on kuitenkin ehkä viimeinen kohde lähes 1000 osuman luettelossa (10 osumaa/sivu). Yksi vinkki GE:lle: Google osaa hakea! Jos vain antaisitte Googlen indeksoida koko verkkosivustonne, asiakkaat löytäisivät kaiken Googlen haun kautta. Monet yritykset käyttävät Googlea sisäisen verkkosivustonsa hakutoimintoon. GE näyttää kuitenkin avaavan hakukoneiden indeksointiroboteille vain tuotesivunsa, mutta ei tukisivujaan. Missä lisenssitiedostomme ovat? Laitteen kokoonpanon päivittämisen jälkeen ongelma jatkui. Lähetettyämme järjestelmäraportin (ja sen jälkeen toisen, ”laajennetun” järjestelmäraportin) GE päätteli, että syynä oli todennäköisesti paikan päällä tehty päivityksemme Windows 7:stä Windows 10:een, koska he havaitsivat joitakin epäsäännöllisyyksiä SystemEventLog.xml-tiedostossa. Minulla ei ollut syytä epäillä tätä selitystä, joten pyysin IT-tiimiltämme puhtaan Windows 10 -asennuksen. Asensin sitten Unicorn 7.5:n, mutta huomasin, että ongelma ei ollut kadonnut. Sivuhuomautuksena: Meillä oli itse aiheutettu ongelma lisenssitiedostomme (.lic) kanssa. Unicornin asennusohjelma vaatii lisenssitiedoston asentamista, mutta en ole koskaan nähnyt sitä ladattavana missään eDelivery-portaalissa (olemme saaneet nämä lisenssitiedostot sähköpostiliitteinä suoraan GE:n tukihenkilöstöltä – miksi niitä ei ole saatavilla ladattavina, kun ne ovat alttiita katoamaan?). Meidän olisi pitänyt tehdä kopio lisenssitiedostostamme ennen kuin tyhjensimme tietokoneemme puhdasta Windows 10 -asennusta varten, mutta unohdimme sen, ja jouduin kaivamaan lisenssitiedoston esiin järjestelmävarmuuskopiosta, jonka olin onneksi tehnyt kyseiselle koneelle vuonna 2016. Ja etsin edelleen lisenssitiedostoja eri järjestelmäkomponenteille (Classic Evaluation ja Column Handling), joita ei ollut vielä asennettu, kun tein järjestelmävarmuuskopion.Paluu Windows 7:äänVarmistaaksemme, ettei kyseessä ollut laitteistovika, päätimme palauttaa järjestelmän takaisin Windows 7:ään ja Unicorn 7.0.2:een. Se osoittautui odotettua vaikeammaksi, koska emme voi enää asentaa Windows 7:ää yliopiston koneille. Onneksi meillä oli vielä yksi vanha, käyttämätön Dell-pöytätietokone, jossa oli Windows 7. Unicorn 7 vaatii kaksi verkkokorttia (yhden yhteydenpitoon ulkomaailman kanssa ja toisen erilliseen 10. verkkoon yhteydenpitoon Äkta Avantin kanssa). Siirsimme verkkokortin vakiokoneeltamme tähän vanhaan Windows 7 -koneeseen. Unicornin asentaminen ja käyttäminen vaatii kuitenkin internetyhteyden, koska ohjelmisto ”soittaa kotiin”. Juuri tämä on kielletty yliopistomme Windows 7 -koneilla. Siksi minun piti perustaa yksityisverkko puhelimeni kautta, jotta Unicorn 7 voisi olla yhteydessä GE:n pääkonttoriin. Vielä pahempaa oli, että minun piti kloonata vakiotietokoneemme MAC-osoite, koska Unicorn 7 -ohjelmistomme on ilmeisesti sidottu tiettyyn tietokoneeseen sen MAC-osoitteen kautta. Langaton internetyhteys ei tullut kyseeseen, koska alkuperäinen MAC-osoite oli peräisin langallisesta verkkokortista. MAC-osoitteiden kloonaus kaapeliliitännällä varustettujen verkkokorttien ja langattomien USB-sovittimien välillä ei ole mahdollista, koska langattomien korttien MAC-osoitteissa on kiinteä etuliite. Siksi jouduin tekemään monimutkaisen asetuksen puhelimestani tietokoneen kautta (kaapeli)reitittimeen ja sieltä Win7-käyttöjärjestelmällä varustettuun Dell-tietokoneeseen.Windows 10:tä ei voi syyttää – syyllinen on F-SecureYllätyksekseni Äkta Avant kaatui jatkuvasti, kun Unicorn 7 Windows 7:ssä antoi komentoja kuten ”pause” tai ”end”. Sitten kuitenkin tajusin, että – toisin kuin vanha Äkta Explorerimme – Avant käyttää laitteiden väliseen viestintään tavallisia verkkokortteja, ja Helsingin yliopiston Windows 10 -versiota on oletusarvoisesti ”parannettu” etäohjaus- ja tietoturvaohjelmistoilla. Menin Ohjauspaneeliin ja poistin kaikki yliopiston asentamat ohjelmistolisäosat. Erityisesti F-Securen Client Security Premium oli niiden ohjelmien joukossa, jotka poistin. Uudelleenkäynnistyksen jälkeen en enää saanut Äkta Avantia kaatumaan. Vahvistaakseni havaintoni asensin verkkokortin takaisin alkuperäiseen oletustietokoneeseemme, käynnistin sen uudelleen ja järjestelmä jumittui Windowsin BitLocker -näyttöön. Laitteistokokoonpanon muuttaminen saa väistämättä Windowsin kieltäytymään käynnistymästä. Tämä hidasti työtäni, koska jouduin ottamaan yhteyttä yliopistomme IT-osastoon, joka on kroonisesti ylikuormitettu ja johon on vaikea saada yhteyttä. Poistin valikoivasti F-Secure Client Security Premium -ohjelman palomuurin käytöstä, ja kaatumiset loppuivat välittömästi myös Windows 10:ssä. On erittäin vaikea perustella, miksi yliopistomme tarvitsisi F-Securen tuotteita. Windowsissa itsessään on (XP SP2:sta lähtien) erittäin tehokas palomuuri, ja siinä on myös oma virustorjuntaohjelmisto ( Windows Security Essentials / Windows Defender ), joka on vähintään yhtä hyvä kuin parhaat kilpailijansa, ja lisäksi se on ilmainen ja täysin integroitu Windowsiin (eikä se vaadi kolmannen osapuolen ohjelmistojen syvällistä integrointia käyttöjärjestelmään).Windows 10 on liian hidas vuoden 2015 laitteistollammeAinoa vaihtoehto on päivittää oletustietokoneemme uudemmalle laitteistolle. Tiedekuntamme oli korvannut vanhat Win7-tietokoneet uusilla koneilla vuonna 2019, mutta tämä tietokone oli yhden päivän liian uusi sisällytettäväksi päivitykseen. Se on kuitenkin jo viisi vuotta vanha, ja erityisesti Windows 10 -päivityksen jälkeen se on erittäin hidas. Kun proteiini eluoituu puhdistuksen aikana, fraktioiden keräämisen ei haluta alkavan muutaman sekunnin kuluttua, vaan heti.

Proteiinien puhdistuskurssi 2019

Wed, 31 Jul 2019 00:00:00 +0000

Järjestämme jälleen joulukuussa laboratoriossamme DPBM-proteiinien puhdistuskurssin. Varmista paikkasi, sillä tämä käytännönläheinen kurssi on suosittu ja paikkoja on vain 16. Voit tuoda mukanasi oman proteiinin, ja räätälöimme kurssiohjelman juuri sinun tarpeidesi mukaan!Lisätietoja: http://research.med.helsinki.fi/corefacilities/b3p/teaching.htmlRegistration : https://courses.helsinki.fi/en/dpbm-135/131042336

Laboratoriokurssi: Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi (DPBM-135)

Sun, 10 Dec 2017 00:00:00 +0000

DPBM-kurssin ”Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi” ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) opetusmateriaali, tulokset jne.:

FPLC (Fast Protein Liquid Chrmatography)

UKunnes lisään uudet tiedot, tutustu tähän dokumentaatioon: /fi/FPLC-course .

Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Järjestämme (jälleen) käytännönläheisen proteiinien puhdistuskurssin 4.–20. joulukuuta. Kurssille mahtuu enintään 16 osallistujaa, jotka jaetaan 2–4 hengen ryhmiin. Jokainen ryhmä tarvitsee kolme kokopäivää käytännön harjoitusten suorittamiseen, mutta kurssin kolmas päivä osuu päällekkäin seuraavan ryhmän ensimmäisen päivän kanssa. Kurssi pidetään Biomedicum Helsingissä, huoneissa A516a1 (jossa laitteet sijaitsevat) ja B318a/b (laboratoriossamme). Puhdistamme proteiinin (VEGF-reseptori 3) kaksivaiheisella menetelmällä (affiniteettikromatografia + geelisuodatus) Äkta Avant FPLC -laitteella. Kurssin kolmantena päivänä mittaamme proteiinin vuorovaikutusta sen ligandin (VEGF-C) kanssa ITC-laitteella (isoterminen kalorimetria). Olemme järjestäneet vastaavan kurssin vuonna 2015 ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Tämä uusi kurssi ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) on rakenteeltaan samanlainen, mutta olemme pidentäneet sitä yhdellä päivällä, jotta voimme analysoida proteiinien vuorovaikutuksia hyödyntämällä B3P-yksikkömme uutta isotermisen kalorimetrian laitetta. Kurssimateriaali ja tulokset ovat saatavilla myös täältä .Koska voimme käsitellä kerrallaan enintään kaksi näytettä (meillä on ”vain” kaksi FPLC-laitetta), joudumme jakamaan osallistujat ryhmiin (2–4 opiskelijaa ryhmässä) ja toistamaan kolmen päivän kurssin useita kertoja osallistujamäärän mukaan.

Arvostelu GE Healthcaren Äkta Avant 25 -laitteesta

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Noin vuosi sitten saimme rahoitusta tiedekunnan sisäisessä hakukierroksessa vanhan Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC -laitteen Proteiinituotannon ja -puhdistuksen yhteislaitoksessa . Äkta Explorer oli hankittu vuonna 1996(?), kun ruotsalainen tuotemerkki Pharmacia oli vielä olemassa. Vuonna 2014 pahin mahdollinen skenaario toteutui, ja sekä monokromaattori että ksenon-salamalamput rikkoutuivat lähes samanaikaisesti, mikä aiheutti meille lähes 10 000 euron laskun. Siksi halusimme korvata laitteen nykyaikaisemmalla mallilla. Tällä alalla on vain kaksi yritystä, jotka tarjoavat luotettavia laitteita: GE Healthcare ( Äkta-tuotelinja ) ja BioRad ( NGC-tuotelinja ). GE Healthcare peri Äkta-tuotemerkin Pharmacialta useiden fuusioiden kautta, kun taas BioRad on suhteellisen uusi kilpailija NGC-malleillaan, jotka se toi markkinoille vasta muutama vuosi sitten.Päätimme valita Äkta Avant 25 . Halusimme ehdottomasti koteloidun, jäähdytetyn fraktiokerääjän. Halusimme myös tutun käyttökokemuksen. Suoritamme usein automatisoituja puhdistuksia, emmekä halua proteiinejamme olevan pitkiä aikoja huoneenlämmössä avoimissa putkissa, joihin bakteerit ja ilmasta tuleva pöly voivat päästä. Tähän mennessä olemme käyttäneet Äkta Avantia noin puoli vuotta, ja meillä on jo hyvä käsitys siitä, miten se vertautuu Äkta Exploreriin. Vaikka Avant on modernimpi kuin Explorer, kaikki ydinlaitoksemme käyttäjät käyttävät edelleen Exploreria. He ovat tottuneet Unicorn 5.11:n käyttöliittymään eivätkä näytä olevan kiinnostuneita oppimaan Avantin – myönnettäköön – monimutkaisempaa käyttöliittymää. Toinen syy siihen, että laitetta on toistaiseksi käytetty vain sisäisesti, oli kuitenkin se, että olemme kohdanneet melkoisen määrän ongelmia. Vanhan Äkta Explorer -laitteemme kanssa emme ole koskaan kohdanneet niin monia ongelmia niin lyhyessä ajassa peräkkäin. En tiedä, onko tilanteemme tyypillinen (GE Healthcaren edustajien mukaan se ei ole). Siitä huolimatta tässä ovat ongelmat, joita olemme kohdanneet:

FPLC-proteiinien puhdistuskurssi

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Kahdeksan jatko-opiskelijaa ilmoittautui joulukuussa järjestettyyn FPLC-proteiinipuhdistuskurssille . Jos jotain opin, niin sen, että kurssin aikana tehtävä proteiinien puhdistus tulisi AINA suorittaa käyttämällä proteiinia ja menetelmää, joita on aiemmin käytetty menestyksekkäästi LUKUISIA kertoja. Opiskelijoiden tuomat proteiinit ovat erinomainen oppimisen lähde, mutta kurssimuodon aikarajoitukset eivät antaneet meille mahdollisuutta saada näiden proteiinien puhdistusta valmiiksi kurssin aikana.Uuden Äkta Avant 25:n tekniset ongelmatLisäksi Äkta Avant 25 , jonka ostimme GE Healthcarelta tänä kesänä, rikkoutui KAKSI KERTAA kurssin aikana. Ensin ohjaus tietokone rikkoutui (RAID-vika). HP toimitti korvaavan kiintolevyn 24 tunnin kuluessa, ja kun RAID oli palautunut, pystyimme jatkamaan kurssia. Kuitenkin ensimmäisen tämän vian jälkeisen ajon aikana Äkta-laitteessa ilmeni ylipaineongelma. Tunnistimme syyksi viallisen virtauksenrajoittimen , mutta emme halunneet jatkaa, koska aiemmissa ajoissa oli ollut vakavia ongelmia ilmakuplien kanssa. Siksi suoritimme ajot vanhalla Äkta Explorer 100 -laitteella. GE Healthcare lähetti nopeasti huoltoteknikon tarkastamaan järjestelmän, mutta koska hänellä ei ollut varaosaa mukanaan, jouduimme odottamaan maanantaihin 14.12. asti, kunnes Äkta Avant oli jälleen täysin toimintakunnossa.Mitä puhdistimme: liukoinen VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) ja HepsinPuhdistimme liukoista ihmisen VEGF-reseptoria 3 (sen solunulkoisen domeenin kolme ensimmäistä domeenia, jotka on liitetty ihmisen IgG:n vakio-Fc-osaan). Tämä on puhdistus, jonka olemme tehneet monta kertaa. Se vastaa vasta-aineiden puhdistusta proteiini A-sefarosella.Olimme valmistaneet etukäteen konditionoidun soluviljelyväliaineen. Tuotamme suurimman osan proteiineistamme hyönteissoluissa (pääasiassa Drosophila S2), ja S2-solut olivat erittäneet VEGFR-3/Fc:n väliaineeseen sen jälkeen, kun metallotioneiinin promoottoria oli indusoitu 1 mM:n Cu2+-pitoisuudella noin 4,5 päivän ajan. Puhdistukseen tarkoitetun väliaineen valmistelu koostuu ainoastaan 1) solujen poistamisesta sentrifugoimalla ja 2) suodattamisesta saostumien ja muiden pienten hiukkasten poistamiseksi, jotka saattaisivat tukkia kolonnin. pH:ta ei tarvitse säätää.Nopea neutralointi matalan pH:n eluution jälkeen ON TÄRKEÄÄJuoksutimme väliaineen kertakäyttöisen 5 ml:n HiTrap-rekombinanttiproteiini A -kolonnin läpi yön noin 1 ml/min nopeudella ja eluoimme matalan pH:n puskurilla. Eluoidut 2 ml:n fraktiot neutraloitiin välittömästi 400 µl:lla 1 M Tris-liuosta (pH 8,5). Tässä vaiheessa teimme pienen virheen toisen puhdistuksen aikana. GE Healthcare ei ollut vielä tuonut markkinoille kasetteja 5 ml:n keräysputkille (eivätkä ole vieläkään tehneet niin, vaikka lupasivat ne jo syyskuuksi 2015), joten käytimme 15 ml:n Falcon-putkia 2 ml:n fraktioiden keräämiseen; niihin olimme etukäteen annostelleet 400 µl neutralointiliuosta. Sekoittuminen näissä putkissa ei kuitenkaan ollut tehokasta, ja pitkäaikainen altistuminen matalalle pH-arvolle johti proteiinimme osittaiseen vaurioitumiseen. Tämä näkyy, kun verrataan ryhmän 2 ja ryhmän 4 kokojakokromatogrammeja: Ryhmässä 4 ensimmäinen piikki (aggregaatti) on paljon suurempi ja heterogeenisempi verrattuna ryhmän 2 vastaavaan piikkiin. Itse asiassa, kun VEGFR-3/Fc eluoidaan matalalla pH:lla proteiini A -kolonneista, se saostuu aina suuremmilla pitoisuuksilla pian eluution jälkeen, mutta liukenee jälleen neutraloinnin yhteydessä. Tätä ei tapahtunut fraktioissa 5.A.3 ja 5.A.4 (ryhmä 4), koska eluaatin ja neutralointipuskurin sekoittuminen 15 ml:n Falcon-putkessa oli tehotonta (myös 2 ml:n fraktiokoko oli todennäköisesti syynä; 1 ml olisi ollut parempi). Ryhmän 2 ajon aikana poistimme putket heti ajon päätyttyä ja sekoitimme siten puskurit, kun taas ryhmän 4 osalta ajo päättyi yöllä ja eluaatti pysyi suurelta osin sekoittumattomana aamuun asti.Vaihtoehtoisesti olisimme voineet eluoida erittäin väkevällä kaootrooppisella suolalla lähes neutraalissa pH:ssa (mitä teemme seuraavalla kerralla, jos meillä on automatisoitu ajo, jossa eluointi tapahtuu keskellä yötä). Pierce tarjoaa (patentoidun) ”hellävaraisen” eluointipuskurin , jonka pH on 6,6. En tiedä Piercen puskurin koostumusta, mutta se on erittäin tiheä liuos jostakin kaootrooppisesta suolasta. 3 M kalium-/natriumtiosyanaattia tai 4 M magnesiumkloridia puskuroiduissa liuoksissa, joiden pH on noin 7, käytetään usein kaootrooppisina suoloina tähän tarkoitukseen. Hepsin Opiskelijoiden toimittamat proteiinit olivat haastavia. Ensinnäkin niiden pitoisuudet lähtöaineessa olivat hyvin alhaiset. Vaikka proteiini näkyy selvästi, kun VEGFR-3/Fc-konditionoitu elatusaine ajetaan PAGE-geelillä ja värjätään Coomassie-värillä, Hepsinille ei näy tällaista kaistaa. Lisäksi näytti siltä, että merkittävä osa proteiinista ei (enää) sisällä histagiinia, minkä vuoksi sitä ei saata talteen ensimmäisessä puhdistusvaiheessa. Se osa Hepsin-H6:sta, joka sitoutuu Ni2+-sefarosiin, eluoituu jo 20 mM:n imidatsolipitoisuudella, mikä vaikeuttaa kolonnin pesua. Hepsin, jossa on pidempi histagiini (H10), selviää 20 mM:n imidatsolipesusta, mutta sen ilmentymistasot ovat myös alhaiset. Alla on yksittäisten ajojen kromatogrammit ja merkityt kuvat Coomassie-värjätyistä PAGE-geeleistä. Äkta Avant 25:n käytön yksityiskohtainen ohje on vielä valmistumassa…