GE Healthcare on Michael’s Domain

Showdown: GE Healthcaren Äkta vastaan Bio-Radin NGC

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Olen puhdistanut proteiineja vuodesta 1996 lähtien. Työskentelin Äkta Explorer -laitteella vuoteen 2015 asti, jolloin päivitimme laitteistomme Äkta Avant -malliin. Vuonna 2020 laboratoriomme muutti, ja saimme käyttöön Bio-Rad NGC -laitteen, jota olemme käyttäneet nyt kahden vuoden ajan.Bio-Rad NGC:n kanssa kohtasimme monia ongelmia. Aluksi ajattelin, että tämä saattaisi olla normaalia järjestelmänvaihdon yhteydessä. Odotin ongelmien häviävän yksi kerrallaan. Olihan meillä ollut ongelmia myös silloin, kun vaihdoimme Explorerista Avant-laitteeseen.Kuitenkin kahden vuoden ja kymmenien puhdistuskierrosten jälkeenkin NGC:n ongelmat eivät näytä loppuvan. Aina kun ratkaisemme yhden ongelman, ilmestyy uusi, aiemmin tuntematon ongelma. Ja toisin kuin GE Healthcare, Bio-Radin asiakaspalvelu ei ole lähelläkään sitä, mitä olemme kokeneet GE Healthcaren kanssa. Kun IT-osastomme ei saanut Äktaa kytkettyä yliopistomme verkkoon, GE Healthcare lähetti Münchenin tiimistään insinöörin Helsinkiin korjaamaan ongelman. GE Healthcare arvosti oppimiskäyräämme ja tarjosi lisäksi jollekin tiimimme jäsenelle ilmaisen osallistumisen yhteen kursseistaan. Eikä heidän tukensa rajoittunut takuuaikaan! He todella halusivat meidän olevan tyytyväisiä laitteeseensa. Emme koe saavamme yhtä paljon tukea Bio-Radilta. Tuntuu aina siltä, että meidän on pakotettava heidät ratkaisemaan NGC:n kanssa kohtaamamme ongelmat, ja heidän vasteaikansa on selvästi alle asiakkaiden odotusten.Tämä on ensimmäinen useista blogikirjoituksista, joissa verrataan Äktaa ja NGC:tä. Toivon, että löydän aikaa kirjoittaa tarkemmin kaikista ongelmistamme seuraavien kuukausien aikana.Päätimme vuonna 2015, että tarvitsimme vihdoin uuden FPLC:n. Äkta Explorer -laitteemme oli tulossa käyttöikänsä päähän, ja olimme saaneet noin 100 000 rahoitusta keskuslaitoksemme FPLC:n uusimiseen. Laite oli niin kallis, että meidän piti käydä läpi virallinen tarjouskilpailumenettely (tuolloin raja oli 30 000 €, mutta se on sittemmin nostettu 60 000 €:ksi). Kilpailijoita oli vain kaksi: Bio-Rad Discover NGC ja GE Healthcare Äkta Avant. Bio-Rad oli halvempi (82 810 € verrattuna 95 470 €), mutta päätimme ostaa GE Healthcaren laitteen. Yksi tärkeä syy oli se, että kaikki käyttäjämme olivat tottuneet käyttämään Äkta Exploreria ja sen Unicorn-ohjelmistoa. Vaihtaminen olisi yksinkertaisesti häiritsevää ja vaatisi meiltä paljon tukea ja aikaa. Oli kuitenkin myös teknisiä syitä, joiden vuoksi pidimme Äktaa parempana kuin NGC:tä: Äkta Avantin edut

Parantunut sietokyky

Tue, 27 Nov 2018 00:00:00 +0000

Uskon vakaasti, että yritykset ovat aidosti kiinnostuneita saamaan rakentavaa palautetta. Sen pitäisi olla vähintäänkin osa niiden yrityksen selviytymisvaistoa. Kun tyytymättömät asiakkaat yksinkertaisesti vaihtavat toiseen toimittajaan antamatta palautetta, vahinko on jo tapahtunut. Siksi annan aina palautetta, jos tuote ei täytä korkeita laatuodotuksiani. Tällä kertaa kirjoitan kuitenkin tuotteesta, johon olen ollut erittäin tyytyväinen, nimittäin uudesta GE Healthcare Superdex 75 Increase 10/300 GL . Kyseessä on geelisuodatuskolonni ja edellisen [Superdex 75 10/300 GL] -mallin ( https://www.gelifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/superdex-75-10300-gl-and-5150-gl-p-05899 ) -mallin versio, jota olemme käyttäneet viimeiset 30 vuotta. ”Increase”-mallin suurin etu on sen parempi paineenkestävyys. Muutama viikko sitten ylikuormitettu jatko-opiskelija unohti sulkea kolonnin käytön jälkeen ja palautti sen jääkaappiin, jossa 20-prosenttinen etanoli haihtui hitaasti seuraavien kahden viikon aikana. Jääkaappi on tuuletettu, ja kun tarvitsin kolonnia, vahinko oli jo tapahtunut: Siellä oli ehkä 8 mm:n rako ja noin yhden tuuman pituinen kuiva vyöhyke oli muodostunut. Täytin välittömästi kuolleet tilavuudet kaasuttamattomalla 20-prosenttisella etanolilla ja aloitin erittäin hitaan ajon (0,05 ml/min) useaksi tunniksi, minkä jälkeen vaihdoin kaasuttamattomaan veteen ja sitten puskuriin. Noin kahden päivän ajon jälkeen rako oli pienentynyt noin 3 millimetriin. Jäljellä oleva rako poistettiin säätämällä yläadapteria (minun piti kiristää se mahdollisimman tiukalle). Nyt minun piti testata ”korjattu” kolonnia. Tein sekä toimintatestin (erottamalla kaksi proteiinia PBS:ssä) että asetonitestin (injektoimalla 100 µl 2-prosenttista asetonia veteen). Olin valtavan yllättynyt, kun asetonitesti osoitti noin 19 000 teoreettista levyä (mikä on enemmän kuin mitä olemme koskaan saaneet vanhoilla Superdex 75 -kolonneillamme). Ja kahden proteiinin (RNaseA ja BSA) erottelu osoitti, että kolonnin toiminta on edelleen täysin kunnossa. Emme kuitenkaan voi sallia minkäänlaista geelikompressiota, sillä adapterin kyky korjata sitä on käytetty täysimääräisesti (GE Healthcare valmisti aiemmin pidempää adapteria, jonka avulla olisimme voineet kompensoida vielä enemmän, mutta he päättivät lopettaa tämän tuotteen valmistuksen).Sekä jatko-opiskelija että minä olimme helpottuneita näiden tulosten jälkeen, sillä uuden kolonnin ostaminen olisi tullut meille kalliiksi (2 200 €), ja koska meillä ei ole erillistä rahoitusta yhteiskäyttölaitoksemme ylläpitoon, olisin joutunut siirtämään tämän kustannuksen jatko-opiskelijan laboratorion vastuulle. Valitettavasti en ottanut kuvaa vaurioituneesta kolonnista, sillä vaistomainen reaktioni oli aloittaa pelastustoimet välittömästi. Alla olevassa kuvassa näkyvä kolonnin on kuitenkin se vaurioitunut kolonnin, kun pelastustoimet oli saatu päätökseen.

Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Järjestämme (jälleen) käytännönläheisen proteiinien puhdistuskurssin 4.–20. joulukuuta. Kurssille mahtuu enintään 16 osallistujaa, jotka jaetaan 2–4 hengen ryhmiin. Jokainen ryhmä tarvitsee kolme kokopäivää käytännön harjoitusten suorittamiseen, mutta kurssin kolmas päivä osuu päällekkäin seuraavan ryhmän ensimmäisen päivän kanssa. Kurssi pidetään Biomedicum Helsingissä, huoneissa A516a1 (jossa laitteet sijaitsevat) ja B318a/b (laboratoriossamme). Puhdistamme proteiinin (VEGF-reseptori 3) kaksivaiheisella menetelmällä (affiniteettikromatografia + geelisuodatus) Äkta Avant FPLC -laitteella. Kurssin kolmantena päivänä mittaamme proteiinin vuorovaikutusta sen ligandin (VEGF-C) kanssa ITC-laitteella (isoterminen kalorimetria). Olemme järjestäneet vastaavan kurssin vuonna 2015 ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Tämä uusi kurssi ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) on rakenteeltaan samanlainen, mutta olemme pidentäneet sitä yhdellä päivällä, jotta voimme analysoida proteiinien vuorovaikutuksia hyödyntämällä B3P-yksikkömme uutta isotermisen kalorimetrian laitetta. Kurssimateriaali ja tulokset ovat saatavilla myös täältä .Koska voimme käsitellä kerrallaan enintään kaksi näytettä (meillä on ”vain” kaksi FPLC-laitetta), joudumme jakamaan osallistujat ryhmiin (2–4 opiskelijaa ryhmässä) ja toistamaan kolmen päivän kurssin useita kertoja osallistujamäärän mukaan.

Unicorn 7:n käyttäjien määrittäminen edellyttää manuaalista toimenpidettä verkkokäyttäjäympäristössä

Fri, 17 Jun 2016 00:00:00 +0000

Unicorn, Äkta Avant, Äkta Explorer, GE Healthcare, Windows, verkkotodennus, käyttäjän määrittäminen, menetelmä, tulos, tiede, proteiinien puhdistus Koska käytämme Äkta Avant -laitettamme monikäyttäjäympäristössä, meidän on erotettava eri käyttäjien menetelmät ja tulokset toisistaan. Oletusasetuksina jokainen verkkokäyttäjä voi tällä hetkellä nähdä kaikki menetelmät ja tulokset, jotka kuka tahansa muu verkkokäyttäjä on laitteella tuottanut. Tämä on merkittävä yksityisyys- ja turvallisuusongelma, sillä pahantahtoinen käyttäjä voisi poistaa (tai vielä pahempaa: muokata) menetelmiä ja tuloksia.Äkta-laitteemme on konfiguroitu siten, että käyttäjät voivat kirjautua Unicorn 7 -tietokoneeseen yliopiston käyttäjätunnuksella ja salasanalla tavallisen Windows-verkkotodennusmekanismin kautta. Jos kuitenkin useat henkilöt jakavat vastuun yhdestä mittaussarjasta, tämä järjestely ei ole mahdollinen, sillä heidän olisi paljastettava salasanansa toisilleen. Siksi olemme luoneet paikallisen tilin, jota voivat käyttää ne käyttäjät, jotka haluavat jakaa Äkta-laitteen käytön. Windowsiin kirjautumisen jälkeen käyttäjien on vielä kirjauduttava Unicorn 7 -ohjelmistoon, minkä he tekevät yliopiston käyttäjätunnuksella ja salasanalla (“Windows-todennus”). Tässä järjestelyssä jokainen käyttäjä voi nähdä kaikki menetelmät ja tulokset, mikä ei ole hyväksyttävää. Kun uusi käyttäjä määritetään Unicorn-ohjelmistossa (valikko ”Access > Folders”), voidaan määrittää tarkasti, mihin kansioihin kyseisellä käyttäjällä on pääsy, jolloin käyttäjä näkee vain omat menetelmänsä ja tuloksensa. Koska Unicorn 5:n kansiorakenne noudatti Windows-tiedostojärjestelmän kansiorakennetta, käyttäjät pystyivät aina kopioimaan menetelmiä ja tuloksia kansiosta toiseen ja saamaan ne siten käyttöönsä huolimatta Unicorn 5 -ohjelman asettamista rajoituksista.Kun luin ensimmäisen kerran, että Unicorn 7 tukee Windowsin verkkoautentikointia, toivoin, että voisimme välttää sen työlään käyttäjien määrittämisen, jonka jouduimme suorittamaan jokaisen käyttäjän kohdalla Äkta Explorerissa. Vaiva jatkuu kuitenkin, sillä käyttöoikeuksien määrittäminen kerran ryhmälle ei takaa käyttäjien eristämistä.Ensinnäkin Unicorn 7:ssä ei voi rajoittaa yksittäisten käyttäjien käyttöoikeuksia, vaan ainoastaan ryhmien käyttöoikeuksia. Meidän piti luoda yksi käyttöoikeusryhmä jokaiselle verkkokäyttäjälle, lisätä verkkokäyttäjä tähän ryhmään, luoda ryhmälle erillinen kotikansio ja sitten rajoittaa kansion käyttöoikeudet tähän kotikansioon. Muutaman käyttäjän kohdalla tarvittiin satoja napsautuksia, sillä oletusasetuksena on, ettei käyttäjällä ole pääsyä mihinkään, ja jokainen käyttöoikeusvalintaruutu on aktivoitava paitsi järjestelmänvalvojan oikeudet. Tässä suhteessa Windows (ja kaikki muut käyttöjärjestelmät) on paljon älykkäämpi kuin Unicorn. Jos yliopiston työntekijä kirjautuu koneelle, johon hän ei ole aiemmin kirjautunut, järjestelmä luo automaattisesti kaiken tarvittavan oletusarvoisen paikallisen kansiorakenteen ja liittää kyseisen käyttäjän yksityisen kotikansion ilman, että hänelle myönnetään pääsyä mihinkään muuhun, mitä muut työntekijät ovat kyseisellä koneella tehneet. Mielestäni tämän pitäisi olla vaihtoehto myös Unicornissa. Ehkä se onkin, enkä vain osaa löytää sitä? Toinen suuri haittapuoli edellä kuvatussa menetelmässä, jossa jokainen käyttäjä erotetaan omaan käyttöoikeusryhmäänsä, on se, että Unicorn-ohjelmaan kirjautuminen muuttuu suureksi koettelemukseksi: käyttäjänimen ja salasanan kirjoittamisen lisäksi käyttäjän on valittava oikea käyttöoikeusryhmä, jotta kirjautuminen onnistuu. Ja mikä vielä pahempaa: meidän järjestelmässämme emme voi välttää sitä, että jokainen yliopiston työntekijä kuuluu kahteen käyttöoikeusryhmään: manuaalisesti luotuun käyttöoikeusryhmään käyttäjien erottelua varten ja ”oletusryhmään”, joka toimii Windowsin verkkoautentikoinnin kautta – ehkä Kerberos?). Siksi, jos käyttäjät valitsevat oletuskäyttöoikeusryhmän (jota meidän tapauksessamme kutsutaan nimellä ”Users”), he pääsevät kirjautumaan sisään, mutta eivät näe omia menetelmiään ja tuloksiaan.On kaksi syytä, miksi emme voi poistaa ”Users”-käyttöoikeusryhmää: Ensinnäkin se on tiedekunnan määräys, ja toiseksi (ja olemme yrittäneet) emme voi enää poistaa sitä, koska monet ovat jo luoneet menetelmiä ja tuottaneet tuloksia ollessaan ”Users”-käyttöoikeusryhmässä. Näin ollen UNICORN estää meitä poistamasta tätä tiliä. Työstän parhaillaan tätä ongelmaa: minun pitäisi pystyä pääsemään suoraan taustalla olevaan MS-SQL-tietokantaan, jotta voisin muuttaa menetelmien ja tulosten omistajuutta. GE ei kuitenkaan ollut kovin avomielinen, kun kysyin käyttöoikeuksien hallinnasta. Vastaus oli: ”Itsenäisessä UNICORN-ratkaisussa tietokannan käyttöoikeustiedot on salattu, eikä niitä julkisteta.” Jos sinulla olisi yritysratkaisu (jossa isännöit omaa (SQL Server) -tietokantaasi), sinulla olisi hallintaoikeudet tunnistetietoihin ja teoriassa voisit poimia halutut tiedot (muoto on sellainen, jonka joudut selvittämään itse, emmekä me tue sitä). Voit päivittää ratkaisusi yritysversioon, jos haluat. Tämä kuulostaa pahemmalta kuin se on, koska meillä on fyysinen pääsy MS-SQL-palvelimeen ja käyttöoikeustietojen poimiminen ei vaikuta kovin vaikealta. Mutta minulta vie aikaa löytää haavoittuvuus, jonka avulla voin ”murtautua omaan järjestelmäämme”, ja juuri se ärsyttää minua. GE:n Lisa Bromarkin mukaan 7.0.2-päivitys näyttää kuitenkin korjaavan tämän ongelman: UNICORN voidaan konfiguroida käyttämään uutta tietokantasalasanaa. On mahdollista luoda salattu salasana tai syöttää jo salattu salasana. Tämä tehdään ajamalla UNICORN Service Tool -työkalu UNICORNin asennuksen jälkeen.Päivityksen saaminen on kuitenkin uskomattoman vaikeaa (ainakin se näyttää vievän viikkoja). Jakelu tapahtuu ilmeisesti edelleen optisilla tallennusvälineillä ja postitse. Luulen, että viimeksi hankin ohjelmiston CD- tai DVD-levyltä yli 10 vuotta sitten. GE kertoi minulle kuitenkin, että he ovat juuri siirtämässä UNICORN-ohjelmistopäivityksiä ”sähköiseen jakeluun”. Tervetuloa 21. vuosisadalle!

Unicorn 7:n käyttäjien erottelu edellyttää manuaalista toimenpidettä verkkokäyttäjäympäristössä

Mon, 09 May 2016 00:00:00 +0000

Koska käytämme Äkta Avant -laitettamme monikäyttäjäympäristössä, meidän on erotettava eri käyttäjien menetelmät ja tulokset toisistaan. Oletusasetusten mukaan jokainen verkkokäyttäjä voi tällä hetkellä nähdä kaikki menetelmät ja tulokset, jotka joku muu verkkokäyttäjä on tuottanut laitteella. Tämä on merkittävä yksityisyys- ja turvallisuusongelma, sillä pahantahtoinen käyttäjä voisi poistaa (tai vielä pahempaa: muokata) menetelmiä ja tuloksia.Äkta-laitteemme on konfiguroitu siten, että käyttäjät voivat kirjautua Unicorn 7 -tietokoneeseen yliopiston käyttäjätunnuksella ja salasanalla tavallisen Windows-verkkotodennusmekanismin kautta. Jos kuitenkin useat henkilöt jakavat vastuun yhdestä ajosta, tämä järjestely ei ole mahdollinen, sillä heidän pitäisi paljastaa salasanansa toisilleen. Siksi olemme luoneet paikallisen tilin, jota voivat käyttää ne käyttäjät, jotka haluavat jakaa Äkta-laitteen käytön. Windowsiin kirjautumisen jälkeen käyttäjien on vielä kirjauduttava Unicorn 7 -ohjelmistoon, minkä he tekevät yliopiston käyttäjätunnuksellaan ja salasanallaan (“Windows-todennus”). Tässä järjestelyssä jokainen käyttäjä voi nähdä kaikki menetelmät ja tulokset, mikä ei ole hyväksyttävää. Kun uusi käyttäjä määritetään Unicorn-ohjelmistossa (valikko ”Access > Folders”), voidaan määrittää tarkasti, mihin kansioihin kyseisellä käyttäjällä on pääsy, jolloin käyttäjä näkee vain omat menetelmänsä ja tuloksensa. Koska Unicorn 5:n kansiorakenne noudatti Windows-tiedostojärjestelmän kansiorakennetta, käyttäjät pystyivät aina kopioimaan menetelmiä ja tuloksia kansiosta toiseen ja saamaan ne siten käyttöönsä huolimatta Unicorn 5 -ohjelman asettamista rajoituksista.Kun luin ensimmäisen kerran, että Unicorn 7 tukee Windowsin verkkotodennusta, toivoin, että voisimme välttää sen työlään käyttäjien määrittämisen, jonka jouduimme suorittamaan jokaisen käyttäjän kohdalla Äkta Explorerissa. Vaiva jatkuu kuitenkin, sillä käyttöoikeuksien määrittäminen kerran ryhmälle ei takaa käyttäjien eristämistä.Ensinnäkin Unicorn 7:ssä ei voi rajoittaa yksittäisten käyttäjien käyttöoikeuksia, vaan ainoastaan ryhmien käyttöoikeuksia. Meidän piti luoda yksi käyttöoikeusryhmä jokaiselle verkkokäyttäjälle, lisätä verkkokäyttäjä tähän ryhmään, luoda ryhmälle erillinen kotikansio ja sitten rajoittaa kansion käyttöoikeudet tähän kotikansioon. Muutaman käyttäjän kohdalla tarvittiin satoja napsautuksia, sillä oletusasetuksena on, ettei käyttäjällä ole pääsyä mihinkään, ja jokainen käyttöoikeusvalintaruutu on aktivoitava paitsi järjestelmänvalvojan oikeudet. Tässä suhteessa Windows (ja kaikki muut käyttöjärjestelmät) on paljon älykkäämpi kuin Unicorn. Jos yliopiston työntekijä kirjautuu koneelle, johon hän ei ole aiemmin kirjautunut, järjestelmä luo automaattisesti kaiken tarvittavan oletusarvoisen paikallisen kansiorakenteen ja liittää kyseisen käyttäjän yksityisen kotikansion ilman, että hänelle myönnetään pääsyä mihinkään muuhun, mitä muut työntekijät ovat kyseisellä koneella tehneet. Mielestäni tämän pitäisi olla vaihtoehto myös Unicornissa. Ehkä se onkin, enkä vain osaa löytää sitä? Toinen suuri haittapuoli edellä kuvatussa menetelmässä, jossa jokainen käyttäjä erotetaan omaan käyttöoikeusryhmäänsä, on se, että Unicorn-ohjelmaan kirjautuminen muuttuu suureksi koitokseksi: käyttäjänimen ja salasanan kirjoittamisen lisäksi käyttäjän on valittava oikea käyttöoikeusryhmä, jotta kirjautuminen onnistuu. Ja mikä vielä pahempaa: meidän järjestelmässämme emme voi välttää sitä, että jokainen yliopiston työntekijä kuuluu kahteen käyttöoikeusryhmään: manuaalisesti luotuun käyttöoikeusryhmään käyttäjien erottelua varten ja ”oletusryhmään”, joka toimii Windowsin verkkoautentikoinnin kautta – ehkä Kerberos?). Siksi, jos käyttäjät valitsevat oletuskäyttöoikeusryhmän (jota meidän tapauksessamme kutsutaan nimellä ”Users”), he pääsevät kirjautumaan sisään, mutta eivät näe omia menetelmiään ja tuloksiaan.On kaksi syytä, miksi emme voi poistaa ”Users”-käyttöoikeusryhmää: Ensinnäkin se on tiedekunnan määräys, ja toiseksi (ja olemme yrittäneet) emme voi enää poistaa sitä, koska monet ovat jo luoneet menetelmiä ja tuottaneet tuloksia ollessaan ”Users”-käyttöoikeusryhmässä. Näin ollen UNICORN estää meitä poistamasta tätä tiliä. Työstän parhaillaan tätä ongelmaa: minun pitäisi pystyä pääsemään suoraan taustalla olevaan MS-SQL-tietokantaan, jotta voisin muuttaa menetelmien ja tulosten omistajuutta. GE ei kuitenkaan ollut kovin avomielinen, kun kysyin käyttöoikeuksien hallinnasta. Vastaus oli: ”Itsenäisessä UNICORN-ratkaisussa tietokannan käyttöoikeustiedot ovat salattuja eivätkä ne ole julkisia.” Jos sinulla olisi yritysratkaisu (jossa isännöit omaa (SQL Server) -tietokantaasi), sinulla olisi hallintaoikeudet tunnistetietoihin ja teoriassa voisit poimia halutut tiedot (muoto on sellainen, jonka joudut selvittämään itse, emmekä me tue sitä). Voit päivittää ratkaisusi yritysversioon, jos haluat. Tämä kuulostaa pahemmalta kuin se on, koska meillä on fyysinen pääsy MS-SQL-palvelimeen ja käyttöoikeustietojen poimiminen ei vaikuta kovin vaikealta. Mutta minulta vie aikaa löytää haavoittuvuus, jonka avulla voin ”murtautua omaan järjestelmäämme”, ja juuri se ärsyttää minua. GE:n Lisa Bromarkin mukaan 7.0.2-päivitys näyttää kuitenkin korjaavan tämän ongelman: UNICORN voidaan konfiguroida käyttämään uutta tietokantasalasanaa. On mahdollista luoda salattu salasana tai syöttää jo salattu salasana. Tämä tehdään ajamalla UNICORN Service Tool -työkalu UNICORNin asennuksen jälkeen.Päivityksen saaminen on kuitenkin uskomattoman vaikeaa (ainakin se näyttää vievän viikkoja). Jakelu tapahtuu ilmeisesti edelleen optisilla tallennusvälineillä ja postitse. Luulen, että viimeksi hankin ohjelmiston CD- tai DVD-levyltä yli 10 vuotta sitten. GE kertoi minulle kuitenkin, että he ovat juuri siirtämässä UNICORN-ohjelmistopäivityksiä ”sähköiseen jakeluun”. Tervetuloa 21. vuosisadalle!

Äkta Avant -fraktiokerääjän toimintaperiaate

Mon, 02 May 2016 00:00:00 +0000

Kun olemme ratkaisseet kaikki Äkta Avant -laitteemme alkuvaikeudet , uskallamme vihdoin antaa asiakkaiden käyttää sitä. Asiakaskuntamme on hyvin monipuolinen: siihen kuuluu niin FPLC:n täydellisiä aloittelijoita kuin kokeneita Äkta Explorer -käyttäjiä (ja kaikkea siltä väliltä). Kun olemme antaneet palautetta GE:lle, näkökulmamme on luonnollisesti painottunut tiettyyn käyttäjäryhmään. Asiakkaiden palveleminen on kuitenkin antanut meille uuden näkökulman, sillä kohtaamme käytettävyysongelmia, joita he eivät pysty ratkaisemaan itse. Haluan tässä mainita vain yhden kompastuskiven, joka on toistuvasti tullut esille: fraktiokerääjän toimintatavan taustalla oleva logiikka. Toisin kuin vanhemmissa järjestelmissä, fraktiokerääjää ei voi nollata manuaalisesti ”ensimmäiseen asentoon” tai mihinkään mielivaltaisesti määriteltyyn asentoon, kuten oli mahdollista esimerkiksi Unicorn 5:n yhteydessä.Meiltä itseltämme kesti melko kauan tottua fraktiokeräysprosessin sisäiseen logiikkaan, ja tarvitsimme ohjausta GE:ltä. Sitä, että järjestelmä ei toimi intuitiivisesti, korostaa se, että jotkut GE:n asiantuntijoilta saamamme vastaukset olivat puutteellisia (mikä johti meille joihinkin ikäviin näytteiden menetyksiin). Lopulta saimme GE:n tukipalvelulta taulukon, joka kuvaa fraktiokerääjän toimintaa (katso alla). Kuitenkin jopa kyseinen taulukko on puutteellinen, ja olemme lisänneet siihen muutaman rivin, jotka kuvaavat joitakin epätyypillisiä tilanteita, joihin taulukko ei tarjoa vastausta. Nämä muutokset ja lisäykset GE:n kuvaukseen on merkitty punaisella.

HiLoad 26/60 Superdex pg -geelisuodatuskromatografiakolonnin suorituskyky

Mon, 11 Apr 2016 00:00:00 +0000

Yleisin käyttämämme proteiinien puhdistustekniikka on geelisuodatus (jota kutsutaan myös kokosuodatuskromatografiaksi). Geelisuodatuksessa proteiinit erotellaan niiden koon perusteella (tai tarkemmin sanottuna niiden ”Stokesin säteen” perusteella, joka määräytyy suurelta osin niiden koon ja muodon mukaan). Suurten proteiinimäärien geelisuodatusta varten hankimme GE Healthcaren HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade noin 9 vuotta sitten (malli 26/60 on korvattu mallilla HiLoad 26/600, mutta molemmat ovat lähes identtisiä). Tällä kolonnilla voidaan erottaa erittäin puhtaasti kaksi proteiinia, joiden kokero ero on 100 %. Siksi se sopii saman proteiinin monomeeristen ja dimeeristen versioiden erottamiseen. Kolonnin ”viimeinen käyttöpäivä” oli maaliskuu 2012. Kokemuksemme mukaan tällainen kolonnin käyttöikä voi asianmukaisessa käsittelyssä helposti olla 10–15 vuotta (emme käytä sitä kovin usein, säilytämme sitä 20-prosenttisessa etanolissa, ja jos emme tarvitse sitä pidempään aikaan, säilytämme sitä +4 °C:ssa).

Arvostelu GE Healthcaren Äkta Avant 25 -laitteesta

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Noin vuosi sitten saimme rahoitusta tiedekunnan sisäisessä hakukierroksessa vanhan Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC -laitteen Proteiinituotannon ja -puhdistuksen yhteislaitoksessa . Äkta Explorer oli hankittu vuonna 1996(?), kun ruotsalainen tuotemerkki Pharmacia oli vielä olemassa. Vuonna 2014 pahin mahdollinen skenaario toteutui, ja sekä monokromaattori että ksenon-salamalamput rikkoutuivat lähes samanaikaisesti, mikä aiheutti meille lähes 10 000 euron laskun. Siksi halusimme korvata laitteen nykyaikaisemmalla mallilla. Tällä alalla on vain kaksi yritystä, jotka tarjoavat luotettavia laitteita: GE Healthcare ( Äkta-tuotelinja ) ja BioRad ( NGC-tuotelinja ). GE Healthcare peri Äkta-tuotemerkin Pharmacialta useiden fuusioiden kautta, kun taas BioRad on suhteellisen uusi kilpailija NGC-malleillaan, jotka se toi markkinoille vasta muutama vuosi sitten.Päätimme valita Äkta Avant 25 . Halusimme ehdottomasti koteloidun, jäähdytetyn fraktiokerääjän. Halusimme myös tutun käyttökokemuksen. Suoritamme usein automatisoituja puhdistuksia, emmekä halua proteiinejamme olevan pitkiä aikoja huoneenlämmössä avoimissa putkissa, joihin bakteerit ja ilmasta tuleva pöly voivat päästä. Tähän mennessä olemme käyttäneet Äkta Avantia noin puoli vuotta, ja meillä on jo hyvä käsitys siitä, miten se vertautuu Äkta Exploreriin. Vaikka Avant on modernimpi kuin Explorer, kaikki ydinlaitoksemme käyttäjät käyttävät edelleen Exploreria. He ovat tottuneet Unicorn 5.11:n käyttöliittymään eivätkä näytä olevan kiinnostuneita oppimaan Avantin – myönnettäköön – monimutkaisempaa käyttöliittymää. Toinen syy siihen, että laitetta on toistaiseksi käytetty vain sisäisesti, oli kuitenkin se, että olemme kohdanneet melkoisen määrän ongelmia. Vanhan Äkta Explorer -laitteemme kanssa emme ole koskaan kohdanneet niin monia ongelmia niin lyhyessä ajassa peräkkäin. En tiedä, onko tilanteemme tyypillinen (GE Healthcaren edustajien mukaan se ei ole). Siitä huolimatta tässä ovat ongelmat, joita olemme kohdanneet:

FPLC-proteiinien puhdistuskurssi

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Kahdeksan jatko-opiskelijaa ilmoittautui joulukuussa järjestettyyn FPLC-proteiinipuhdistuskurssille . Jos jotain opin, niin sen, että kurssin aikana tehtävä proteiinien puhdistus tulisi AINA suorittaa käyttämällä proteiinia ja menetelmää, joita on aiemmin käytetty menestyksekkäästi LUKUISIA kertoja. Opiskelijoiden tuomat proteiinit ovat erinomainen oppimisen lähde, mutta kurssimuodon aikarajoitukset eivät antaneet meille mahdollisuutta saada näiden proteiinien puhdistusta valmiiksi kurssin aikana.Uuden Äkta Avant 25:n tekniset ongelmatLisäksi Äkta Avant 25 , jonka ostimme GE Healthcarelta tänä kesänä, rikkoutui KAKSI KERTAA kurssin aikana. Ensin ohjaus tietokone rikkoutui (RAID-vika). HP toimitti korvaavan kiintolevyn 24 tunnin kuluessa, ja kun RAID oli palautunut, pystyimme jatkamaan kurssia. Kuitenkin ensimmäisen tämän vian jälkeisen ajon aikana Äkta-laitteessa ilmeni ylipaineongelma. Tunnistimme syyksi viallisen virtauksenrajoittimen , mutta emme halunneet jatkaa, koska aiemmissa ajoissa oli ollut vakavia ongelmia ilmakuplien kanssa. Siksi suoritimme ajot vanhalla Äkta Explorer 100 -laitteella. GE Healthcare lähetti nopeasti huoltoteknikon tarkastamaan järjestelmän, mutta koska hänellä ei ollut varaosaa mukanaan, jouduimme odottamaan maanantaihin 14.12. asti, kunnes Äkta Avant oli jälleen täysin toimintakunnossa.Mitä puhdistimme: liukoinen VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) ja HepsinPuhdistimme liukoista ihmisen VEGF-reseptoria 3 (sen solunulkoisen domeenin kolme ensimmäistä domeenia, jotka on liitetty ihmisen IgG:n vakio-Fc-osaan). Tämä on puhdistus, jonka olemme tehneet monta kertaa. Se vastaa vasta-aineiden puhdistusta proteiini A-sefarosella.Olimme valmistaneet etukäteen konditionoidun soluviljelyväliaineen. Tuotamme suurimman osan proteiineistamme hyönteissoluissa (pääasiassa Drosophila S2), ja S2-solut olivat erittäneet VEGFR-3/Fc:n väliaineeseen sen jälkeen, kun metallotioneiinin promoottoria oli indusoitu 1 mM:n Cu2+-pitoisuudella noin 4,5 päivän ajan. Puhdistukseen tarkoitetun väliaineen valmistelu koostuu ainoastaan 1) solujen poistamisesta sentrifugoimalla ja 2) suodattamisesta saostumien ja muiden pienten hiukkasten poistamiseksi, jotka saattaisivat tukkia kolonnin. pH:ta ei tarvitse säätää.Nopea neutralointi matalan pH:n eluution jälkeen ON TÄRKEÄÄJuoksutimme väliaineen kertakäyttöisen 5 ml:n HiTrap-rekombinanttiproteiini A -kolonnin läpi yön noin 1 ml/min nopeudella ja eluoimme matalan pH:n puskurilla. Eluoidut 2 ml:n fraktiot neutraloitiin välittömästi 400 µl:lla 1 M Tris-liuosta (pH 8,5). Tässä vaiheessa teimme pienen virheen toisen puhdistuksen aikana. GE Healthcare ei ollut vielä tuonut markkinoille kasetteja 5 ml:n keräysputkille (eivätkä ole vieläkään tehneet niin, vaikka lupasivat ne jo syyskuuksi 2015), joten käytimme 15 ml:n Falcon-putkia 2 ml:n fraktioiden keräämiseen; niihin olimme etukäteen annostelleet 400 µl neutralointiliuosta. Sekoittuminen näissä putkissa ei kuitenkaan ollut tehokasta, ja pitkäaikainen altistuminen matalalle pH-arvolle johti proteiinimme osittaiseen vaurioitumiseen. Tämä näkyy, kun verrataan ryhmän 2 ja ryhmän 4 kokojakokromatogrammeja: Ryhmässä 4 ensimmäinen piikki (aggregaatti) on paljon suurempi ja heterogeenisempi verrattuna ryhmän 2 vastaavaan piikkiin. Itse asiassa, kun VEGFR-3/Fc eluoidaan matalalla pH:lla proteiini A -kolonneista, se saostuu aina suuremmilla pitoisuuksilla pian eluution jälkeen, mutta liukenee jälleen neutraloinnin yhteydessä. Tätä ei tapahtunut fraktioissa 5.A.3 ja 5.A.4 (ryhmä 4), koska eluaatin ja neutralointipuskurin sekoittuminen 15 ml:n Falcon-putkessa oli tehotonta (myös 2 ml:n fraktiokoko oli todennäköisesti syynä; 1 ml olisi ollut parempi). Ryhmän 2 ajon aikana poistimme putket heti ajon päätyttyä ja sekoitimme siten puskurit, kun taas ryhmän 4 osalta ajo päättyi yöllä ja eluaatti pysyi suurelta osin sekoittumattomana aamuun asti.Vaihtoehtoisesti olisimme voineet eluoida erittäin väkevällä kaootrooppisella suolalla lähes neutraalissa pH:ssa (mitä teemme seuraavalla kerralla, jos meillä on automatisoitu ajo, jossa eluointi tapahtuu keskellä yötä). Pierce tarjoaa (patentoidun) ”hellävaraisen” eluointipuskurin , jonka pH on 6,6. En tiedä Piercen puskurin koostumusta, mutta se on erittäin tiheä liuos jostakin kaootrooppisesta suolasta. 3 M kalium-/natriumtiosyanaattia tai 4 M magnesiumkloridia puskuroiduissa liuoksissa, joiden pH on noin 7, käytetään usein kaootrooppisina suoloina tähän tarkoitukseen. Hepsin Opiskelijoiden toimittamat proteiinit olivat haastavia. Ensinnäkin niiden pitoisuudet lähtöaineessa olivat hyvin alhaiset. Vaikka proteiini näkyy selvästi, kun VEGFR-3/Fc-konditionoitu elatusaine ajetaan PAGE-geelillä ja värjätään Coomassie-värillä, Hepsinille ei näy tällaista kaistaa. Lisäksi näytti siltä, että merkittävä osa proteiinista ei (enää) sisällä histagiinia, minkä vuoksi sitä ei saata talteen ensimmäisessä puhdistusvaiheessa. Se osa Hepsin-H6:sta, joka sitoutuu Ni2+-sefarosiin, eluoituu jo 20 mM:n imidatsolipitoisuudella, mikä vaikeuttaa kolonnin pesua. Hepsin, jossa on pidempi histagiini (H10), selviää 20 mM:n imidatsolipesusta, mutta sen ilmentymistasot ovat myös alhaiset. Alla on yksittäisten ajojen kromatogrammit ja merkityt kuvat Coomassie-värjätyistä PAGE-geeleistä. Äkta Avant 25:n käytön yksityiskohtainen ohje on vielä valmistumassa…

Kuinka muuntaa EMF-tiedostot SVG-muotoon

Tue, 06 Mar 2007 00:00:00 +0000

Tämä tarve syntyi, koska Äkta Explorer -laitetta ohjaava Unicorn-ohjelmisto pystyy viemään raakakromatografiakäyriä vain EMF-muodossa. Surkeaa. Kokeillessani erilaisia vaihtoehtoja päädyin OpenOfficeen. OpenOffice Draw pystyy tuomaan EMF-tiedostoja ja tallentamaan ne SVG-muodossa. Muita sovelluksia, jotka pystyvät avaamaan EMF-tiedostoja, ovat FreeHand ja CorelDraw (testattu Macintoshilla). FreeHand ei kuitenkaan pysty viemään tiedostoja SVG-muotoon.