Kloonaus on Michael’s Domain

OCAA-kirjaston Entry-vektorin (pENTR221) DNA-sekvenssin kokoaminen

Fri, 30 Oct 2020 00:00:00 +0000

Tämä artikkeli on tarkoitettu molekyylikloonausta harjoittaville. Tarkemmin sanottuna niille, joiden on käsiteltävä Gateway-vektoreita. Oletetaan, että olet saanut joltakulta Gateway-kloonin. Tiedät insertin sekvenssin ja tiedät vektorin runko-osat. Yksi yleisimmistä runko-osista on pENTR221. Otetaan esimerkkinä insertiksi ihmisen CTSL1-cDNA, tarkemmin sanottuna klooni-ID 100010639 OCAA-kloonikokoelmasta. Tiedät insertin sekvenssin sen rekisteröintinumerosta (BC012612).Haluat tämän vektorin täydellisen DNA-sekvenssin, jotta voit käyttää älykästä kloonausohjelmistoa, kuten SnapGene , apuna kloonaussuunnittelussasi. Tämä ohjelmisto edellyttää kuitenkin, että sinulla on konstruktin täydellinen sekvenssi (tai ainakin sen tärkeiden osien täydellinen sekvenssi). Miten siis selvität pENTR221-CTSL1-kloonin täydellisen sekvenssin? Insertisekvenssin saat NCBI:stä : Kirjoita vain kloonillesi saatu rekisteröintinumero. Lataa sekvenssi Fasta- tai Genbank-muodossa. Mielenkiintoista kyllä, muuten niin älykäs SnapGene-ohjelmisto ei tunne pENTR221-vektoria. Joten sinun täytyy googlettaa vektorin runko ”pENTR221 DNA sequence”. Tuloksia löytyy paljon, ja tässä on vain neljä niistä: 1. http://dnasu.org/DNASU/GetVectorDetail.do?vectorid=2792 . https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=279 3. https://www.genomics-online.com/vector-backbone/48/pentr221/4 . http://yrgene.com/documents/vector/pentr221.pdfMatthias , neljännen lähteen kirjoittaja, esittää sekvenssin PDF-tiedostossa, mitä ei suositella. Jos kopioit DNA-sekvenssin tästä tiedostosta, se sekoittuu kokonaan, koska PDF-tiedosto ei lue 10 nukleotidin ryhmittelyjä rivi riviltä. Hyvä Matthias, älä käytä PDF-tiedostoa DNA-sekvenssien jakeluun tai dokumentointiin! Jos sinun on pakko tehdä niin, liitä PDF-tiedostoon tekstitiedosto, jossa on nukleotidisekvenssi! Tietenkin voit purkaa DNA-sekvenssin oikeassa järjestyksessä älykkäällä PDF-työkalulla, kuten PDF Studio Prolla. Jostain outosta syystä kolmannen URL-osoitteen sekvenssi poikkeaa muista neljästä, sillä se on ainoa, jossa on täydelliset kiinnityskohdat (attL1 ja attL2). Ei kuitenkaan ole väliä, mitä sekvenssiä käytät kokoonpanossa, koska erot ovat kaikki alueella, joka poistetaan kokoonpanoprosessin aikana (en tiedä, miten pENTR221-vektori valmisteltiin kirjaston kloonausta varten tässä nimenomaisessa esimerkissäni, mutta minusta näyttää siltä, että alkuperäinen vektori avattiin yhdellä DraI-pilkkomisella (joka luo tasaiset päät) ja sitten lisättiin ensin linkkeri ja sen jälkeen insertti. Ehdotan, että käytät kolmannesta URL-osoitteesta löytyvää sekvenssiä (koska se on Fasta-muodossa) ja tuot sen SnapGeneen, jolloin SnapGene tunnistaa yhteiset piirteet. Nyt tarvitset vielä linkkerin. Mistä tiedät, mitä linkkeriä on käytetty? Saamme suurimman osan Gateway-klooneistamme sisäisestä OCAA-kloonikokoelman kopiosta, ja voit ladata täydellisen klooniluettelon Excel-taulukkona täältä . Tiedot sisältävät jokaisesta kloonista käytetyn linkkerin (5’-linkkereitä on 8 erilaista ja 3’-linkkereitä 16 erilaista). Valitettavasti näyttää siltä, että tässä Excel-taulukossa on joitakin virheitä, sillä joissakin linkkereissä on stop-kodoni, mutta ne on silti merkitty ”ilman stop-kodonia” ja päinvastoin. Esimerkkikloonissamme on käytetty seuraavia linkkereitä: 5’-linkkeri: GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG 3’-linkkeri:TAGGACCCAGCTTTCTTGTACLähes kaikki 5’-linkkerit sisältävät Kozak-sekvenssin (CACC) viimeisinä nukleotideina ennen insertin alkua, ja muutamat sisältävät Kozakin lisäksi itse ATG:n (kuten yllä oleva). Linkkerin toisessa päässä homologisen sekvenssin tunnistaa helposti pENTR221-runko-osien attL1:n päästä (GTACAAAAAAG). 3’-linkkerit ovat heterogeenisempia, mutta ne kaikki sisältävät attL2:n CTTTCTTG-sekvenssin. Kun niitä käytetään stop-kodonin sisältävien kloonien tekemiseen, ne kaikki alkavat juuri kyseisellä stop-kodonilla (TAG, TGA tai TAA).Nyt sinun tarvitsee vain kopioida inserttijakson avoin lukukehys linkkerisekvenssien väliin. Jos 3’-linkkerissäsi on aloituskoodoni ATG, sinun on ohitettava se. Älä myöskään kopioi stop-koodonia, koska ”stop-koodonilla varustetuissa klooneissa” se sisältyy aina linkkeriin ja ”stop-koodonittomissa klooneissa” et halua sitä mukaan. Tässä esimerkissä tämä sekvenssi käsittää nukleotidit 202–1197 rekisteröintinumerosta BC012612 . Se olisi:AATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGNyt lisätään linkkeri (ensimmäinen ja viimeinen rivi):GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTAGGACCCAGCTTTCTTGTACNyt meillä on ensimmäinen ongelma: 3’-linkkerissä on pysäytyskodoni (heti viimeisen rivin alussa), vaikka klooni on saamamme tiedon mukaan ”ilman stop-kodonia”.Olemme sekvensoineet kloonin ja todenneet, että ainoa ero stopkodonilla varustetun ja ilman stopkodonia olevan kloonin välillä on mutaatio, joka muuttaa TAG-stopkodonin TTG-kodoniksi (leusiini). Joten vaihdamme yhden A-nukleotidin yllä olevassa sekvenssissä T-nukleotidiksi:GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTTGGACCCAGCTTTCTTGTACViimeinen vaihe on lisätä tämä sekvenssi tyhjään pENTR221-sekvenssiin, jonka olemme avanneet SnapGene-ohjelmassa. Käytännössä valitset 32 nukleotidia kohdista 652–687 ja korvaat ne yllä olevalla sekvenssillä. Voilà! Valitettavasti se, että linkkereitä ei aina ole merkitty oikein, herättää minussa huonoa aavistusta. Oman kokemuksemme mukaan Orfeomen kirjastokopiot sisältävät kuitenkin niin paljon virheitä, että on joka tapauksessa suositeltavaa sekvensoida koko insertti käyttämällä T7- tai M13 rev -alukkeita 3’-päästä ja M13 fwd -aluketta 5’-päästä. Tällä tavoin saat selville mahdolliset linkkerivirheet, joita on tehty kloonien annotoinnissa.

SnapGene ja osittaiset restriktioentsyymihajotukset uudelleen tarkasteltuna

Thu, 23 Aug 2018 00:00:00 +0000

SnapGene on ohjelmisto laboratoriossa työskenteleville molekyylibiologeille, jotka tekevät paljon kloonaustyötä (konstruktien suunnittelu ja annotointi). Siitä lähtien, kun viimeksi kirjoitin SnapGene-ohjelmistosta ( https://www.snapgene.com/ ), on tapahtunut monia hyviä asioita:

Kloonauskerho

Wed, 22 Jun 2016 00:00:00 +0000

Järjestämme yhdessä biolääketieteen tohtoriohjelman (DPBM) kanssa syksyllä 2016 työpajan ja käytännön kurssin kloonauksesta (kurssikoodi 921244).Päivämäärät ja paikka (työpaja): Viikoittainen keskustelutyöpaja (8 kertaa, kukin 1–1,5 tuntia) alkaa tiistaina 30.8.2016; paikka: kokoushuone 7 (Biomedicum Helsinki, 5. kerros, paitsi 27.9. ja viimeinen työpaja 25.10., jotka pidetään huoneessa BM B136A); 1 opintopistePäivämäärät ja paikka (käytännön kurssi): Hajautettu laboratoriokurssi (osallistujien aikataulun ja paikan mukaan tai – niille osallistujille, joilla ei ole pääsyä tarvittaviin tiloihin – marraskuun kahden ensimmäisen viikon aikana laboratoriossamme); 1 opintopisteKurssin tietosivu: http://www.helisci.fi/hbgs/cloning-club2016 Ilmoittautumissivu: https://elomake.helsinki.fi/lomakkeet/71701/lomake.html Yksityiskohtaiset kurssitiedot: PDF Mainosjuliste: PDF Kurssimateriaali: Materiaalia lisätään tänne jokaisen tapaamisen jälkeen Kloonaus on houkuttelevaa juuri siksi, että se on tylsää. Kaikki alkaa kuitenkin DNA:sta. Geenitekniikka ei ole tullut jäädäkseen, vaan sen merkitys kasvaa entisestään: olemme vasta raapaisseet sen potentiaalin pintaa. Lähes kaikessa biolääketieteellisessä tutkimuksessa käytetään DNA-rakenteita: ilmentymisvektoreita solujen transfektioon, shuttle-plasmideja virusten valmistukseen sekä rakenteita transgeenisten eläinten tuottamiseen. Taitoa DNA-rakenteen luomiseen tarvitaan vielä siihen asti, kunnes markkinoille saapuu se luvattu laite, joka tuottaa minkä tahansa plasmidiin muutaman tunnin kuluttua siitä, kun sille on syötetty plasmidiin sekvenssi.Käytettävissä on monia uusia tekniikoita, minkä vuoksi valinta on vaikeampaa kuin vanhoina aikoina, jolloin restriktioentsyymikloonaus oli ainoa vaihtoehto. Nykyään vaatimukset ja vaihtoehdot ovat rajattomat, ja menestyksen ja nopeuden maksimoimiseksi on valittava oikea strategia.

SnapGene – Yksinkertaisesti paras DNA:n käsittelyohjelmisto

Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 +0000

Laboratoriossamme on käytetty erilaisia ohjelmistopaketteja DNA-rakenteiden suunnitteluun, dokumentointiin ja visualisointiin. Niistä, joista olemme jo pitkään pitäneet erityisen paljon, ovat Textcon GeneConstructionKit (GCK) ja Clone Manager (Professional) . Jälkimmäinen toimii valitettavasti vain Windowsissa. Koska useat tietokoneistamme käyttävät kuitenkin Ubuntu Linuxia , käytimme GCK:n versioita 2.5 ja 3 WINE:n -ohjelmalla (yhteensopivuuskerros, jonka avulla voimme käyttää alkuperäisiä Windows-ohjelmia Linuxissa). Päivityksen myötä versioon 4 GCK muuttui kuitenkin WINE:n alla käyttökelvottomaksi hitaudeksi, joten aloimme etsiä sille korvaajaa. Otimme yhteyttä GCK:n kehittäjiin, mutta he eivät ilmeisesti olleet halukkaita tai kykeneviä auttamaan meitä. Oletan, että GCK:n koodipohja on luultavasti yli 20 vuotta vanha, ja siksi kukaan ei uskalla koskea siihen. Juuri tuolloin SnapGene julkaistiin, ja se täytti lähes kaikki vaatimuksemme:

2 viikon laboratoriokurssi

Tue, 30 Dec 2014 00:00:00 +0000

En ollut lainkaan tietoinen siitä, kuinka paljon työtä käytännön laboratoriokurssin järjestäminen vaatii. Jos olisin tiennyt, Pirjo olisi joutunut paljon vaikeampaan tilanteeseen yrittäessään suostutella minua pitämään tämän kurssin DPBM-tohtorikoululle . Kari oli varoittanut minua… Kurssiin liittyvä luentokurssi oli ollut käynnissä syyskuusta marraskuuhun. Käytännön kurssille oli tarjolla 16 vapaata paikkaa, mutta se oli täysin epärealistista, kun otetaan huomioon, että meidän tilamme rajoittuivat minun 23,7 neliömetrin laboratorioon. Opetuskäyttöön tarkoitettua laboratoriotilaa on saatavilla, mutta ilman laitteita ja kaikkea muuta tällaiseen hankkeeseen tarvittavaa infrastruktuuria. Käytännön kurssille ilmoittautui kahdeksan henkilöä, ja – onneksi – puolet heistä perui osallistumisensa viime hetkellä, koska heillä ei ollut riittävää mahdollisuutta sitoutua kurssin vaatimaan raskaaseen työmäärään. Näin ollen meillä oli lopulta neljä opiskelijaa ja kolme projektia. Emme olisi missään nimessä selvinneet enempää.Ajatuksena oli tarjota jokaiselle osallistujalle mahdollisuus toteuttaa oma DNA-kloonaus- ja proteiini-ilmentymisprojekti, joka olisi merkityksellinen hänen omille tohtoriopintoilleen. Tätä varten tapasin kolme ryhmää kuukautta etukäteen kloonauksen suunnittelemiseksi ja tarvittavien materiaalien tilaamiseksi. Työskentelimme rinnakkain seuraavien kolmen projektin parissa: