https://jeltsch.org/fi/tags/mutageneesi/Recent content in Mutageneesi on Michael’s DomainHugofiCopyright © 2002 - 2026 Michael Jeltsch.Fri, 24 Jul 2026 00:18:18 +0300https://jeltsch.org/fi/oep/Sat, 21 Jun 2025 00:00:00 +0000https://jeltsch.org/fi/oep/<p>Väitöskirjatutkija kysyi minulta plasmidikarttoja useille DNA-konstrukteille, jotka olin kloonanut noin 20 vuotta sitten. Koska <a href="https://snapgene.com" target="_blank" rel="noopener noreferrer nofollow">SnapGeneä&nbsp; <svg class="svg-inline--fa fas fa-up-right-from-square fa-2xs" fill="currentColor" aria-hidden="true" role="img" viewBox="0 0 512 512" overflow="visible"><use href="#fas-up-right-from-square"></use></svg></a> ei ollut tuolloin olemassa, olin käyttänyt nykyään vanhentunutta GeneConstructionKit2-ohjelmaa. Tein tuohon aikaan paljon klonauksia, mutta en jaksanut karttojen luomista niistä kaikille. GCK2-muoto ei mahdollista helppoa annotointia. Plasmidien kattavaan annotointiin tarvittiin erillinen ohjelma, ja nämä tiedot tallennettiin erilliseen tiedostoon, niin sanottuun ”illstraatiotiedostoon” – mikä voisikaan mennä vikaan? Eilen päädyin kaivamaan esiin vanhat laboratoriomuistiinpanoni ja jäljittämään noin 10 vanhaa klonausta SnapGenessä. En kuitenkaan pystynyt simuloimaan yhtä kloonausta, koska SnapGene oli liian konservatiivinen ja ei sallinut ”huonojen” PCR-alukkeiden (primerien) toiminnan.</p>https://jeltsch.org/fi/mutagenesis/Thu, 26 Nov 2020 00:00:00 +0000https://jeltsch.org/fi/mutagenesis/<p>Jos DNA-konstruktia on tarpeen muokata, yksi yleisesti käytetty menetelmä on PCR-pohjainen mutageneesi, jossa mutaatio sijoitetaan kahden komplementaarisen alukkeen väliin. Vaihtoehtoisesti pidempien lisäysten kohdalla voidaan käyttää aluketunnistetta. Sitten amplifioidaan yksinkertaisesti koko konstruktio PCR:llä. Tämä toimii kohtuullisen hyvin konstruktioille, jotka ovat pienempiä kuin noin 10 kb. Tätä tarkoitusta varten on saatavilla useita kaupallisia sarjoja, jotka eroavat toisistaan yksityiskohdissa. Niistä mainittakoon Agilentin <a href="https://www.agilent.com/en/product/mutagenesis-cloning/mutagenesis-kits/site-directed-mutagenesis-kits" target="_blank" rel="noopener noreferrer nofollow">QuickChange-sarja&nbsp; <svg class="svg-inline--fa fas fa-up-right-from-square fa-2xs" fill="currentColor" aria-hidden="true" role="img" viewBox="0 0 512 512" overflow="visible"><use href="#fas-up-right-from-square"></use></svg></a> ja NEB:n <a href="https://international.neb.com/products/e0552-q5-site-directed-mutagenesis-kit-without-competent-cells" target="_blank" rel="noopener noreferrer nofollow">Q5 SDM -sarja&nbsp; <svg class="svg-inline--fa fas fa-up-right-from-square fa-2xs" fill="currentColor" aria-hidden="true" role="img" viewBox="0 0 512 512" overflow="visible"><use href="#fas-up-right-from-square"></use></svg></a> NEB:ltä sekä <a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F541#/F541" target="_blank" rel="noopener noreferrer nofollow">Phusion Site-Directed Mutagenesis -sarja&nbsp; <svg class="svg-inline--fa fas fa-up-right-from-square fa-2xs" fill="currentColor" aria-hidden="true" role="img" viewBox="0 0 512 512" overflow="visible"><use href="#fas-up-right-from-square"></use></svg></a> ThermoFisheriltä. QuikChange-pakkaus on kallein (myös siksi, että sen ostaa aina yhdessä kompetenttisolujen kanssa), ja NEB:n pakkaus on melko edullinen (minulle täällä Suomessa 168 €). Useimmat pakkaukset on mitoitettu 10 reaktiota varten. Mutta mitä teet, jos haluat tehdä vain yhden tai kaksi mutageneesireaktiota? Ostatko koko sarjan? Kohtasin tämän kysymyksen kaksi viikkoa sitten. Menin entsyymipakastimeemme ja huomasin, että meillä on T4-DNA-ligaasia, polynukleotidikinaasia (PNK) ja Phusion-polymeraasia. Siinä on kaikki, mitä tarvitset oman kohdennetun mutageneesipakkauksen tekemiseen!</p>