PCR on Michael’s Domain

Mahdoton overlap-extension-PCR

Sat, 21 Jun 2025 00:00:00 +0000

Väitöskirjatutkija kysyi minulta plasmidikarttoja useille DNA-konstrukteille, jotka olin kloonanut noin 20 vuotta sitten. Koska SnapGeneä ei ollut tuolloin olemassa, olin käyttänyt nykyään vanhentunutta GeneConstructionKit2-ohjelmaa. Tein tuohon aikaan paljon klonauksia, mutta en jaksanut karttojen luomista niistä kaikille. GCK2-muoto ei mahdollista helppoa annotointia. Plasmidien kattavaan annotointiin tarvittiin erillinen ohjelma, ja nämä tiedot tallennettiin erilliseen tiedostoon, niin sanottuun ”illstraatiotiedostoon” – mikä voisikaan mennä vikaan? Eilen päädyin kaivamaan esiin vanhat laboratoriomuistiinpanoni ja jäljittämään noin 10 vanhaa klonausta SnapGenessä. En kuitenkaan pystynyt simuloimaan yhtä kloonausta, koska SnapGene oli liian konservatiivinen ja ei sallinut ”huonojen” PCR-alukkeiden (primerien) toiminnan.

Edullinen PCR-pohjainen mutageneesipakkaus

Thu, 26 Nov 2020 00:00:00 +0000

Jos DNA-konstruktia on tarpeen muokata, yksi yleisesti käytetty menetelmä on PCR-pohjainen mutageneesi, jossa mutaatio sijoitetaan kahden komplementaarisen alukkeen väliin. Vaihtoehtoisesti pidempien lisäysten kohdalla voidaan käyttää aluketunnistetta. Sitten amplifioidaan yksinkertaisesti koko konstruktio PCR:llä. Tämä toimii kohtuullisen hyvin konstruktioille, jotka ovat pienempiä kuin noin 10 kb. Tätä tarkoitusta varten on saatavilla useita kaupallisia sarjoja, jotka eroavat toisistaan yksityiskohdissa. Niistä mainittakoon Agilentin QuickChange-sarja ja NEB:n Q5 SDM -sarja NEB:ltä sekä Phusion Site-Directed Mutagenesis -sarja ThermoFisheriltä. QuikChange-pakkaus on kallein (myös siksi, että sen ostaa aina yhdessä kompetenttisolujen kanssa), ja NEB:n pakkaus on melko edullinen (minulle täällä Suomessa 168 €). Useimmat pakkaukset on mitoitettu 10 reaktiota varten. Mutta mitä teet, jos haluat tehdä vain yhden tai kaksi mutageneesireaktiota? Ostatko koko sarjan? Kohtasin tämän kysymyksen kaksi viikkoa sitten. Menin entsyymipakastimeemme ja huomasin, että meillä on T4-DNA-ligaasia, polynukleotidikinaasia (PNK) ja Phusion-polymeraasia. Siinä on kaikki, mitä tarvitset oman kohdennetun mutageneesipakkauksen tekemiseen!

Kapa HiFi on loistava, Phusion toimii tavallaan, Q5 ja Platinum SuperFi tuottavat pettymyksen

Fri, 02 Dec 2016 00:00:00 +0000

Viimeisin NEBuilder-kokoonpanoni juuttui, koska en saanut kahta PCR-reaktiota toimimaan. Tarvitsin yhden pienen fragmentin ja kaksi noin 3 kb:n fragmenttia. Minun piti lisätä 2A-sekvenssi pienen fragmentin ja yhden 3 kb:n fragmentin väliin, joten lisäsin tarvittavat sekvenssit alukkeiden päihin. Malli ei ollut erityisen GC-rikas, ei mitään liian monimutkaista, mutta ensimmäisellä yritykselläni amplifioitui vain pieni fragmentti. Kun myöskään toisella yritykselläni ei onnistunut amplifioida 3 kb:n fragmentteja, päätin kokeilla joitakin vaihtoehtoisia polymeraaseja. Kloonauskäyttöön olen viime vuosina käyttänyt yksinomaan Phusion High Fidelity -DNA-polymeraasia (valmistaja New England Biolabs tai ThermoFisheriltä ), mutta ehkä oli olemassa jotain parempaa ja luotettavampaa? Sain kolme erilaista ilmaista näytettä testattavaksi: KAPA HiFi HotStart , NEB Q5® High-Fidelity sekä ThermoFisher Platinum SuperFi™ . Tutkijakoulutettavani suoritti PCR-reaktiot eilen, ja minä ajoin geelit tänään. Geelien laadusta voi nähdä, että rutiinini on hieman ruostunut, mutta tulokset ovat kokonaisuudessaan varsin selkeät, ja tulevaisuudessa KAPA tulee olemaan ensisijainen valintamme vaikeiden templaattien kanssa. Mielestäni KAPA:n korjauskyky on hieman Phusionia heikompi, mutta en välitä siitä, jos 2 % DNA-tuotteista sisältää mutaation 0,5 %:n sijaan.Liitteenä olevasta PDF-tiedostosta näet, että jatko-opiskelijani lisäsi kaksi ylimääräistä näytettä Phusion-polymeraasille, joissa hän käytti samoja olosuhteita, mutta erilaista templaattia (superkiertynyt plasmidi lineaarisen DNA:n sijaan). Yllättäen Phusion-polymeraasi onnistui amplifioimaan superkiertyneestä DNA:sta paljon paremmin kuin (samasta) lineaarisesta DNA:sta; en osaa selittää tätä…

Kuinka paljon PCR-tuotetta voi saada?

Thu, 10 Mar 2016 00:00:00 +0000

Kuinka paljon PCR-tuotetta tyypillisestä PCR-reaktiosta saadaan? 50–120 ng/µl näyttää olevan tyypillinen tulos, mutta se riippuu suuresti käytetyistä PCR-olosuhteista. Jos alukepitoisuutta on vähennettävä spesifisyyden maksimoimiseksi, saanto voi olla huomattavasti pienempi. Toisaalta, jos spesifisyys ei ole ongelma (esim. joissakin PCR-kloonauksissa), saanto voi olla moninkertainen.Tarkastellaan tyypillistä yhden PCR-reaktion enimmäismäärää, joka on 100 µl. Oletetaan, että spesifisyys ei ole ongelma ja voimme siksi käyttää suuria määriä alukkeita (kumpikin 1 µM) ja dNTP:itä (0,2 µM). Koska jokaisen kaksisäikeisen PCR-tuotteen molekyylin synteesi kuluttaa yhden alukkeen, kaksisäikeisen (ds) DNA-tuotteen teoreettinen suurin moolikonsentraatio on sama kuin alukkeen pitoisuus: 1 µM. 1 µM dsDNA:ta vastaisi 100 pmolia 100 µl:n PCR-reaktiossa. Kuinka paljon se on mikrogrammoina? Se riippuu tietysti PCR-tuotteen pituudesta: esimerkiksi 100 pmol 1000 bp:n dsDNA:ta vastaa 66 µg. Voiko todella saada niin paljon? Ei tässä 1000 bp:n tuotteen esimerkissä. Syynä on se, että DNA:n rakennuspalikat, dNTP:t, loppuvat kauan ennen alukkeita. 1000 bp:n tuotteen tapauksessa vain 40 % alukkeista on käytetty loppuun, kun dNTP:t loppuvat (olettaen, että amplikonin GC:n ja AT:n suhde on 50:50). Yhden 1000 bp:n dsPCR-tuotteen molekyylin valmistamiseen tarvitaan noin 2000 dNTP-molekyyliä. Esimerkissämme 400 bp:n PCR-tuote olisi siis optimaalinen, koska sekä alukkeet että dNTP:t loppuvat samaan tahtiin.Vaikuttaa siltä, että jos haluat saada suurempia määriä pidempiä PCR-tuotteita, sinun pitäisi lisätä dNTP-pitoisuutta. Kuitenkin esimerkissämme, jossa tuotteen pituus on 1000 bp, PCR-tuotteen teoreettinen enimmäismäärä on noin 26 µg, mikä on valtava määrä ja riittää useimpiin sovelluksiin. Verkossa on laskin, jonka avulla voi kokeilla eri alukkeiden ja dNTP-pitoisuuksien sekä tuotteen pituuksien yhdistelmiä: http://www.bioline.com/us/media/calculator/01_14.html

Kaava oligonukleotidien annealing-lämpötilan laskemiseksi PCR:ää varten

Wed, 30 Aug 2006 00:00:00 +0000

PCR-alukkeen annealing-lämpötilan laskemisen nyrkkisääntö on: Tm (°C) = 81,5 + 0,41(%GC) – (675/N), jossa %GC on G- ja C-nukleotidien prosenttiosuus oligonukleotidissa ja N on oligonukleotidin pituus nukleotideina ilmaistuna.