Streptomysiinin ja spektinomysiinin vastustuskyky

Sun, 11 Jan 2015 00:00:00 +0000

Monet ORFeome-geenikokoelman cDNA-kloonit toimitetaan pENTR223.1-plasmidissa*. Näiden kloonien viljelyyn useimmat käyttävät spektinomysiiniä, koska niin antibioottiresistenssigeeni on nimetty ORFeome-yhteistyön kartoissa ja koska protokolla sitä edellyttää. Kirjallisuutta tarkemmin tarkasteltaessa käy kuitenkin ilmi, että sama valintamarkkeri toimisi yhtä hyvin myös streptomysiinillä. No, mikä on ero? Pääasiassa hinta: kun 5 grammaa Sigma-valmistajan spektinomysiiniä maksaa täällä Suomessa 112,7 € (Sigma 85555-5G) , sama määrä streptomysiiniä maksaa vain 17,80 €, eli se on yli kuusi kertaa halvempaa (Sigma S6501-5G) .pENTR223.1:n resistenssigeeni on aminoglykosidi-adenyylitransferaasigeeni aadA (streptomysiini 3’’(9)-O-nukleotidyylitransferaasi; aminoglykosidi 3"-adenyylitransferaasi (AAD(3”)(9); ANT(3”)(9)), joka antaa resistenssin sekä spektinomysiinille että streptomysiinille. On kuitenkin olemassa samankaltaisia aminoglykosidi-adenyylitransferaaseja, jotka eivät anna resistenssiä molemmille antibiooteille, vaan vain jommallekummalle. Siksi sinun on tiedettävä tarkalleen, mitä spektinomysiiniresistenssigeeniä plasmidi kantaa, jos haluat korvata spektinomysiinin halvemmalla streptomysiinillä. Plasmidikartat eivät useinkaan ole avuksi: olen nähnyt, että pENTR223.1:ssä oleva aadA-geeni on merkitty SmR:llä (streptomysiiniresistenssi, kuten SnapGenessä) tai SpnR:llä (spektinomysiiniresistenssi, kuten ORFeome-kokoelman kartoissa).Testatakseni kokeellisesti, vahvistaako pENTR223.1 resistenssin molemmille antibiooteille, viljelin insertin sisältävää pENTR223.1-plasmidia 100 µg/ml:n spektinomysiini- ja 100 µg/ml:n streptomysiinipitoisuudessa, ja se kasvoi hyvin molemmissa olosuhteissa, kun taas transformoimaton emokanta E. coli (NEB5-alpha) ei kasvanut kummassakaan. Erot eivät kuitenkaan ole aina selkeitä, kun tarkastellaan näiden antibioottien eri pitoisuuksia. Streptomysiiniä/spektinomysiiniä inaktivoivat aminoglykosidi-adenyylitransferaasit ovat substraattispesifisiä, mutta eivät yksinomaan. Tämä tarkoittaa, että jonkin verran resistenssiä matalalle streptomysiinipitoisuudelle voi johtua aminoglykosidi-adenyylitransferaasista, joka kohdistuu ensisijaisesti spektinomysiiniin (tai päinvastoin). Käytännössä jotkut niistä ovat kuitenkin riittävän eksklusiivisia, jotta ne voidaan luokitella joko SmR- tai SpnR-tyyppisiksi. Jos haluat tietää, voit aina kokeilla sitä… Toinen asia, jonka opin tätä tehdessäni, on se, että negatiivinen valintamarkkeri ccdB EI TOIMI XL1 Blue -kannassa, kun taas se toimii NEB5-alpha-kannassa. Ilmeisesti ccdB ei toimi myöskään DH5alpha- ja JM109-kannoissa (mikä ero on DH5alpha- ja NEB5alpha-kannoilla?).* pENTR-223.1:tä kutsutaan myös nimillä pDONR-223.1 tai pENTR223.1-Sfi, koska inserttiä reunustavat kaksi SfiI-kohtaa. Ihmiset kutsuvat plasmidiä yleensä pDONR:ksi ennen cDNA:n lisäämistä ja pENTR:ksi, jos plasmidi sisältää cDNA:n. Tämä käyttötapa ei kuitenkaan ole yleispätevä. Insertin lisäämisen jälkeen (Gateway BP -reaktiolla) pDONR223.1-vektori menettää ccdB- ja chlR/CmR-selektiomarkkerit, ja tuloksena olevaa runkoa kutsutaan useimmiten nimellä pENTR223.1.

PENTR223.1 on Michael’s Domain

Streptomysiinin ja spektinomysiinin vastustuskyky