Kapa HiFi on loistava, Phusion toimii tavallaan, Q5 ja Platinum SuperFi tuottavat pettymyksen

Fri, 02 Dec 2016 00:00:00 +0000

Viimeisin NEBuilder-kokoonpanoni juuttui, koska en saanut kahta PCR-reaktiota toimimaan. Tarvitsin yhden pienen fragmentin ja kaksi noin 3 kb:n fragmenttia. Minun piti lisätä 2A-sekvenssi pienen fragmentin ja yhden 3 kb:n fragmentin väliin, joten lisäsin tarvittavat sekvenssit alukkeiden päihin. Malli ei ollut erityisen GC-rikas, ei mitään liian monimutkaista, mutta ensimmäisellä yritykselläni amplifioitui vain pieni fragmentti. Kun myöskään toisella yritykselläni ei onnistunut amplifioida 3 kb:n fragmentteja, päätin kokeilla joitakin vaihtoehtoisia polymeraaseja. Kloonauskäyttöön olen viime vuosina käyttänyt yksinomaan Phusion High Fidelity -DNA-polymeraasia (valmistaja New England Biolabs tai ThermoFisheriltä ), mutta ehkä oli olemassa jotain parempaa ja luotettavampaa? Sain kolme erilaista ilmaista näytettä testattavaksi: KAPA HiFi HotStart , NEB Q5® High-Fidelity sekä ThermoFisher Platinum SuperFi™ . Tutkijakoulutettavani suoritti PCR-reaktiot eilen, ja minä ajoin geelit tänään. Geelien laadusta voi nähdä, että rutiinini on hieman ruostunut, mutta tulokset ovat kokonaisuudessaan varsin selkeät, ja tulevaisuudessa KAPA tulee olemaan ensisijainen valintamme vaikeiden templaattien kanssa. Mielestäni KAPA:n korjauskyky on hieman Phusionia heikompi, mutta en välitä siitä, jos 2 % DNA-tuotteista sisältää mutaation 0,5 %:n sijaan.Liitteenä olevasta PDF-tiedostosta näet, että jatko-opiskelijani lisäsi kaksi ylimääräistä näytettä Phusion-polymeraasille, joissa hän käytti samoja olosuhteita, mutta erilaista templaattia (superkiertynyt plasmidi lineaarisen DNA:n sijaan). Yllättäen Phusion-polymeraasi onnistui amplifioimaan superkiertyneestä DNA:sta paljon paremmin kuin (samasta) lineaarisesta DNA:sta; en osaa selittää tätä…

Phusion on Michael’s Domain

Kapa HiFi on loistava, Phusion toimii tavallaan, Q5 ja Platinum SuperFi tuottavat pettymyksen