Proteiinin Puhdistus on Michael’s Domain

Proteiinien tuotanto ammattilaisia paremmin

Thu, 31 Oct 2024 00:00:00 +0000

Onnittelut, Laura ja Akseli! Artikkelinne Scientific Reports -lehdessä ( https://doi.org/10.1038/s41598-024-77104-3 ) on vankka tutkimus, jolla on merkitystä paitsi sydän- ja verisuonitautien kannalta myös työmme kannalta, jota teemme lipedeemaan/lipoedeemaan (ja siten mahdollisesti jopa lymfedeemaan, joka on ollut tutkimuksemme pääkohde aiemmin). Sepelvaltimotaudin ja lipedeeman välillä on hämmästyttäviä yhtäläisyyksiä, sillä molempia voidaan pitää rasvan varastointihäiriöinä.Kiitos myös Khushbulle ja Betülille siitä, että he auttoivat Lauraa tuottamaan ja puhdistamaan niin korkealaatuista LCAT-proteiinia, joka toimi paremmin kuin kaupallisesti saatavilla olevat proteiinivalmisteet! Ehkä suuri osa salaisuudesta piili siinä, että pystyimme saavuttamaan korkeat ilmentymistasot verrattuna muihin järjestelmiin. Kokeilimme ensimmäistä kertaa HEK293T-soluja räätälöidyllä CHO-vektorilla ( pCHOKE-B-LCAT-H6 ), ja se toimi yllättävän hyvin. pCHOKE-B koottiin alusta alkaen, ja siihen sisällytettiin useita vuosien varrella kehitettyjä parannuksia verrattuna tavallisiin CHO-ilmentymisvektoreihin. Vektori sisältää

Showdown: GE Healthcaren Äkta vastaan Bio-Radin NGC

Tue, 07 Feb 2023 00:00:00 +0000

Olen puhdistanut proteiineja vuodesta 1996 lähtien. Työskentelin Äkta Explorer -laitteella vuoteen 2015 asti, jolloin päivitimme laitteistomme Äkta Avant -malliin. Vuonna 2020 laboratoriomme muutti, ja saimme käyttöön Bio-Rad NGC -laitteen, jota olemme käyttäneet nyt kahden vuoden ajan.Bio-Rad NGC:n kanssa kohtasimme monia ongelmia. Aluksi ajattelin, että tämä saattaisi olla normaalia järjestelmänvaihdon yhteydessä. Odotin ongelmien häviävän yksi kerrallaan. Olihan meillä ollut ongelmia myös silloin, kun vaihdoimme Explorerista Avant-laitteeseen.Kuitenkin kahden vuoden ja kymmenien puhdistuskierrosten jälkeenkin NGC:n ongelmat eivät näytä loppuvan. Aina kun ratkaisemme yhden ongelman, ilmestyy uusi, aiemmin tuntematon ongelma. Ja toisin kuin GE Healthcare, Bio-Radin asiakaspalvelu ei ole lähelläkään sitä, mitä olemme kokeneet GE Healthcaren kanssa. Kun IT-osastomme ei saanut Äktaa kytkettyä yliopistomme verkkoon, GE Healthcare lähetti Münchenin tiimistään insinöörin Helsinkiin korjaamaan ongelman. GE Healthcare arvosti oppimiskäyräämme ja tarjosi lisäksi jollekin tiimimme jäsenelle ilmaisen osallistumisen yhteen kursseistaan. Eikä heidän tukensa rajoittunut takuuaikaan! He todella halusivat meidän olevan tyytyväisiä laitteeseensa. Emme koe saavamme yhtä paljon tukea Bio-Radilta. Tuntuu aina siltä, että meidän on pakotettava heidät ratkaisemaan NGC:n kanssa kohtaamamme ongelmat, ja heidän vasteaikansa on selvästi alle asiakkaiden odotusten.Tämä on ensimmäinen useista blogikirjoituksista, joissa verrataan Äktaa ja NGC:tä. Toivon, että löydän aikaa kirjoittaa tarkemmin kaikista ongelmistamme seuraavien kuukausien aikana.Päätimme vuonna 2015, että tarvitsimme vihdoin uuden FPLC:n. Äkta Explorer -laitteemme oli tulossa käyttöikänsä päähän, ja olimme saaneet noin 100 000 rahoitusta keskuslaitoksemme FPLC:n uusimiseen. Laite oli niin kallis, että meidän piti käydä läpi virallinen tarjouskilpailumenettely (tuolloin raja oli 30 000 €, mutta se on sittemmin nostettu 60 000 €:ksi). Kilpailijoita oli vain kaksi: Bio-Rad Discover NGC ja GE Healthcare Äkta Avant. Bio-Rad oli halvempi (82 810 € verrattuna 95 470 €), mutta päätimme ostaa GE Healthcaren laitteen. Yksi tärkeä syy oli se, että kaikki käyttäjämme olivat tottuneet käyttämään Äkta Exploreria ja sen Unicorn-ohjelmistoa. Vaihtaminen olisi yksinkertaisesti häiritsevää ja vaatisi meiltä paljon tukea ja aikaa. Oli kuitenkin myös teknisiä syitä, joiden vuoksi pidimme Äktaa parempana kuin NGC:tä: Äkta Avantin edut

GE:n Äkta Avant -ohjelmiston päivittäminen Windows 10:een

Tue, 18 Feb 2020 00:00:00 +0000

Avant on GE Healthcaren Äkta-sarjan FPLC (nopea proteiinien nestekromatografia) -laitteiden lippulaiva. Käytämme sitä säännöllisesti, ja se on kaikkien käytettävissä Helsingin yliopistossa.Yliopistomme päätti toimia yhteistyössä Microsoftin kanssa ja estää kaiken verkkoliikenteen Windows 7 -tietokoneilta. Koska Äkta-laitettamme (ostettu vuonna 2015) käyttävät monet eri tutkijat, käytämme Microsoftin Active Directorya käyttäjien tunnistamiseen ja laitteen käytön seurantaan. Kun yliopisto lopulta sulki Windows 7 -liikenteen tammikuun lopussa, päivitimme lopulta HP-tietokoneen Windows 7:stä Windows 10:een . Ennen päivitystä otimme yhteyttä GE:hen varmistaaksemme, että FPLC toimisi. Vaikka yliopistomme käyttämän Windows 10:n rakennusnumero (Windows 10 Enterprise, versio 1809, rakennusnumero 17763.1039), ei ollut tuettu missään GE:n vuosien varrella julkaisemassa Unicorn 7 -versiossa (katso tämä ohjelmistoyhteensopivuustaulukko, jota en enää löydä GE:n verkkosivuilta: https://drive.google.com/open?id=1cA33lEqfEr0MIaA8r9TyoQFcxiHWuZsp) , meille vakuutettiin, että ohjelmisto toimisi edelleen. Valitettavasti tämä ei pitänyt paikkaansa.**Paikallinen päivitys vai puhdas asennus?**Teimme Win7:stä Win10:een paikallisen päivityksen. En ole koskaan pitänyt näistä. Edes hieman paremmilla käyttöjärjestelmillä, kuten macOS ja Linux , paikan päällä tehtävät päivitykset eivät ole aina sujuneet ongelmitta. Uusi asennus on aina ollut turvallisempi (ja myös nopeampi) vaihtoehto.YhteysongelmatPäivityksen jälkeen Unicorn 7 alkoi menettää yhteyden Äkta Avant -laitteeseen käynnissä olevien proteiinipuhdistusajojen aikana. Manuaalisissa ajoissa voimme selvästi havaita, että tietyt komennot laukaisivat yhteyden katkeamisen. Äktan LCD-näyttö pimeni ja laite käynnistyi uudelleen. Luonnollisesti epäilimme, että tämä johtui Windows 10:een tehdystä päivityksestä. Koska Unicorn 7.0.2:ta ei ollut testattu toimimaan meidän Windows 10 -versiomme kanssa, halusimme ensin yrittää päivittää Unicorn 7:n versioon, joka oli testattu meidän Win10-versiomme kanssa. Olin jo joulukuussa pyytänyt kyseistä päivitystä GE:ltä, mutta pyyntöni oli jätetty huomiotta, ja minulla oli tuolloin paljon muuta tekemistä, joten en vaivautunut palaamaan asiaan (jälkikäteen ajateltuna suuri virhe).OhjelmistopäivityksetSe, mitä Chrome ja Firefox tekevät viikoittain hiljaa taustalla (käyttäjän huomaamatta), vaatii GE:n tapauksessa käyttäjältä lähes kahden viikon täysipäiväisen panostuksen. Yksinkertainen lataus saattaisi toimia Bio-Rad , mutta GE vaatii monimutkaista, sekavaa, epäselvää, käyttäjäepäystävällistä, jatkuvasti muuttuvaa ja GDPR-säännösten vastaista järjestelmää, joka lisäksi sijaitsee palvelimilla, jotka tuntuvat niin hitailta, että ihmettelee jatkuvasti, onko selainvälilehti jumiutunut. Mitä siihen sanottavaa, GE:n verkkosivut ovat aina olleet tällaisia huolimatta lukuisista uudistuksista ja GE:n digitaalisesta muutoksesta. Minun ja erilaisten GE:n tukiosoitteiden välinen sähköpostiketju käsittää tänään 60 sähköpostia (alkaen ensimmäisestä tukipyynnöstäni 2. joulukuuta 2019). Tämän lisäksi on käyty myös melko paljon puhelinkeskusteluja (koska sähköpostia näyttää usein pidettävän oletuksena ”ei-kiireellisenä”).Tietosuojaan liittyvät huolenaiheet GE:n asiakastietojen käsittelystäKun olin tehnyt lataustilauksen, saanut tarjouksen, vahvistanut tilauksen ja saanut tilausvahvistuksen, sain vihdoin ”luvan” ladata Unicornin uusimman version (eli 7.5). Kirjauduin GE:n ”eDeliveryPortaliin” vain huomatakseni, että pystyin näkemään monien muiden GE-asiakkaiden ohjelmistokäyttöoikeudet ja lataukset, mutta en yhtään omaani. Jonkin verran edestakaisin viestittelyn jälkeen versio 7.5 ilmestyi vihdoin latausluettelooni. Lisenssini puuttuu edelleen tänäkin päivänä. Mutta miksi vaivautua? Voisin käyttää mitä tahansa muuta lisenssiä (väärennettyäni tietokoneeni MAC-osoitteen, sillä ohjelmisto on ilmeisesti sidottu tiettyyn tietokoneeseen sen verkkokortin MAC-osoitteen kautta). Tämä on selvä GDPR:n rikkomus, sillä ei ole mitään syytä, miksi tietoni (käyttöoikeustunnukset, MAC-osoitteet, nimet, sähköpostiosoitteet) pitäisi olla muiden asiakkaiden saatavilla. Voi olla, että GE pitää Helsingin yliopistoa yhtenä asiakkaana; se olisi jo suunnittelultaan GDPR:n vastaista.Järjestelmän konfiguraatiotiedostojen (eli laiteohjelmiston) etsiminenEmme kuitenkaan olleet päivittäneet järjestelmän konfiguraatiotiedostoja, koska en ollut löytänyt niitä GE LifeSciencen verkkosivuilta . Käytössämme oli versio 3, kun taas uusin versio oli 3.6. Huomionarvoista on, että nämä tiedostot sisältävät myös yksittäisten Äkta-komponenttien laiteohjelmiston. Näyttää siltä, että tämä latauslinkki on piilotettu huolellisesti. Tarvitsin GE:n apua sen löytämiseksi. GE LifeScience -verkkosivustolla on hakutoiminto, ja haku jopa löytää kyseisen lataustiedoston. Se on kuitenkin ehkä viimeinen kohde lähes 1000 osuman luettelossa (10 osumaa/sivu). Yksi vinkki GE:lle: Google osaa hakea! Jos vain antaisitte Googlen indeksoida koko verkkosivustonne, asiakkaat löytäisivät kaiken Googlen haun kautta. Monet yritykset käyttävät Googlea sisäisen verkkosivustonsa hakutoimintoon. GE näyttää kuitenkin avaavan hakukoneiden indeksointiroboteille vain tuotesivunsa, mutta ei tukisivujaan. Missä lisenssitiedostomme ovat? Laitteen kokoonpanon päivittämisen jälkeen ongelma jatkui. Lähetettyämme järjestelmäraportin (ja sen jälkeen toisen, ”laajennetun” järjestelmäraportin) GE päätteli, että syynä oli todennäköisesti paikan päällä tehty päivityksemme Windows 7:stä Windows 10:een, koska he havaitsivat joitakin epäsäännöllisyyksiä SystemEventLog.xml-tiedostossa. Minulla ei ollut syytä epäillä tätä selitystä, joten pyysin IT-tiimiltämme puhtaan Windows 10 -asennuksen. Asensin sitten Unicorn 7.5:n, mutta huomasin, että ongelma ei ollut kadonnut. Sivuhuomautuksena: Meillä oli itse aiheutettu ongelma lisenssitiedostomme (.lic) kanssa. Unicornin asennusohjelma vaatii lisenssitiedoston asentamista, mutta en ole koskaan nähnyt sitä ladattavana missään eDelivery-portaalissa (olemme saaneet nämä lisenssitiedostot sähköpostiliitteinä suoraan GE:n tukihenkilöstöltä – miksi niitä ei ole saatavilla ladattavina, kun ne ovat alttiita katoamaan?). Meidän olisi pitänyt tehdä kopio lisenssitiedostostamme ennen kuin tyhjensimme tietokoneemme puhdasta Windows 10 -asennusta varten, mutta unohdimme sen, ja jouduin kaivamaan lisenssitiedoston esiin järjestelmävarmuuskopiosta, jonka olin onneksi tehnyt kyseiselle koneelle vuonna 2016. Ja etsin edelleen lisenssitiedostoja eri järjestelmäkomponenteille (Classic Evaluation ja Column Handling), joita ei ollut vielä asennettu, kun tein järjestelmävarmuuskopion.Paluu Windows 7:äänVarmistaaksemme, ettei kyseessä ollut laitteistovika, päätimme palauttaa järjestelmän takaisin Windows 7:ään ja Unicorn 7.0.2:een. Se osoittautui odotettua vaikeammaksi, koska emme voi enää asentaa Windows 7:ää yliopiston koneille. Onneksi meillä oli vielä yksi vanha, käyttämätön Dell-pöytätietokone, jossa oli Windows 7. Unicorn 7 vaatii kaksi verkkokorttia (yhden yhteydenpitoon ulkomaailman kanssa ja toisen erilliseen 10. verkkoon yhteydenpitoon Äkta Avantin kanssa). Siirsimme verkkokortin vakiokoneeltamme tähän vanhaan Windows 7 -koneeseen. Unicornin asentaminen ja käyttäminen vaatii kuitenkin internetyhteyden, koska ohjelmisto ”soittaa kotiin”. Juuri tämä on kielletty yliopistomme Windows 7 -koneilla. Siksi minun piti perustaa yksityisverkko puhelimeni kautta, jotta Unicorn 7 voisi olla yhteydessä GE:n pääkonttoriin. Vielä pahempaa oli, että minun piti kloonata vakiotietokoneemme MAC-osoite, koska Unicorn 7 -ohjelmistomme on ilmeisesti sidottu tiettyyn tietokoneeseen sen MAC-osoitteen kautta. Langaton internetyhteys ei tullut kyseeseen, koska alkuperäinen MAC-osoite oli peräisin langallisesta verkkokortista. MAC-osoitteiden kloonaus kaapeliliitännällä varustettujen verkkokorttien ja langattomien USB-sovittimien välillä ei ole mahdollista, koska langattomien korttien MAC-osoitteissa on kiinteä etuliite. Siksi jouduin tekemään monimutkaisen asetuksen puhelimestani tietokoneen kautta (kaapeli)reitittimeen ja sieltä Win7-käyttöjärjestelmällä varustettuun Dell-tietokoneeseen.Windows 10:tä ei voi syyttää – syyllinen on F-SecureYllätyksekseni Äkta Avant kaatui jatkuvasti, kun Unicorn 7 Windows 7:ssä antoi komentoja kuten ”pause” tai ”end”. Sitten kuitenkin tajusin, että – toisin kuin vanha Äkta Explorerimme – Avant käyttää laitteiden väliseen viestintään tavallisia verkkokortteja, ja Helsingin yliopiston Windows 10 -versiota on oletusarvoisesti ”parannettu” etäohjaus- ja tietoturvaohjelmistoilla. Menin Ohjauspaneeliin ja poistin kaikki yliopiston asentamat ohjelmistolisäosat. Erityisesti F-Securen Client Security Premium oli niiden ohjelmien joukossa, jotka poistin. Uudelleenkäynnistyksen jälkeen en enää saanut Äkta Avantia kaatumaan. Vahvistaakseni havaintoni asensin verkkokortin takaisin alkuperäiseen oletustietokoneeseemme, käynnistin sen uudelleen ja järjestelmä jumittui Windowsin BitLocker -näyttöön. Laitteistokokoonpanon muuttaminen saa väistämättä Windowsin kieltäytymään käynnistymästä. Tämä hidasti työtäni, koska jouduin ottamaan yhteyttä yliopistomme IT-osastoon, joka on kroonisesti ylikuormitettu ja johon on vaikea saada yhteyttä. Poistin valikoivasti F-Secure Client Security Premium -ohjelman palomuurin käytöstä, ja kaatumiset loppuivat välittömästi myös Windows 10:ssä. On erittäin vaikea perustella, miksi yliopistomme tarvitsisi F-Securen tuotteita. Windowsissa itsessään on (XP SP2:sta lähtien) erittäin tehokas palomuuri, ja siinä on myös oma virustorjuntaohjelmisto ( Windows Security Essentials / Windows Defender ), joka on vähintään yhtä hyvä kuin parhaat kilpailijansa, ja lisäksi se on ilmainen ja täysin integroitu Windowsiin (eikä se vaadi kolmannen osapuolen ohjelmistojen syvällistä integrointia käyttöjärjestelmään).Windows 10 on liian hidas vuoden 2015 laitteistollammeAinoa vaihtoehto on päivittää oletustietokoneemme uudemmalle laitteistolle. Tiedekuntamme oli korvannut vanhat Win7-tietokoneet uusilla koneilla vuonna 2019, mutta tämä tietokone oli yhden päivän liian uusi sisällytettäväksi päivitykseen. Se on kuitenkin jo viisi vuotta vanha, ja erityisesti Windows 10 -päivityksen jälkeen se on erittäin hidas. Kun proteiini eluoituu puhdistuksen aikana, fraktioiden keräämisen ei haluta alkavan muutaman sekunnin kuluttua, vaan heti.

Laboratoriokurssi: Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi (DPBM-135)

Sun, 10 Dec 2017 00:00:00 +0000

DPBM-kurssin ”Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi” ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) opetusmateriaali, tulokset jne.:

FPLC (Fast Protein Liquid Chrmatography)

UKunnes lisään uudet tiedot, tutustu tähän dokumentaatioon: /fi/FPLC-course .

RPU-seminaari 2016

Fri, 24 Jun 2016 00:00:00 +0000

Ladattavat tiedostot

Lataa diat PDF-muodossa.

Lataa PDF

Äkta Avant -fraktiokerääjän toimintaperiaate

Mon, 02 May 2016 00:00:00 +0000

Kun olemme ratkaisseet kaikki Äkta Avant -laitteemme alkuvaikeudet , uskallamme vihdoin antaa asiakkaiden käyttää sitä. Asiakaskuntamme on hyvin monipuolinen: siihen kuuluu niin FPLC:n täydellisiä aloittelijoita kuin kokeneita Äkta Explorer -käyttäjiä (ja kaikkea siltä väliltä). Kun olemme antaneet palautetta GE:lle, näkökulmamme on luonnollisesti painottunut tiettyyn käyttäjäryhmään. Asiakkaiden palveleminen on kuitenkin antanut meille uuden näkökulman, sillä kohtaamme käytettävyysongelmia, joita he eivät pysty ratkaisemaan itse. Haluan tässä mainita vain yhden kompastuskiven, joka on toistuvasti tullut esille: fraktiokerääjän toimintatavan taustalla oleva logiikka. Toisin kuin vanhemmissa järjestelmissä, fraktiokerääjää ei voi nollata manuaalisesti ”ensimmäiseen asentoon” tai mihinkään mielivaltaisesti määriteltyyn asentoon, kuten oli mahdollista esimerkiksi Unicorn 5:n yhteydessä.Meiltä itseltämme kesti melko kauan tottua fraktiokeräysprosessin sisäiseen logiikkaan, ja tarvitsimme ohjausta GE:ltä. Sitä, että järjestelmä ei toimi intuitiivisesti, korostaa se, että jotkut GE:n asiantuntijoilta saamamme vastaukset olivat puutteellisia (mikä johti meille joihinkin ikäviin näytteiden menetyksiin). Lopulta saimme GE:n tukipalvelulta taulukon, joka kuvaa fraktiokerääjän toimintaa (katso alla). Kuitenkin jopa kyseinen taulukko on puutteellinen, ja olemme lisänneet siihen muutaman rivin, jotka kuvaavat joitakin epätyypillisiä tilanteita, joihin taulukko ei tarjoa vastausta. Nämä muutokset ja lisäykset GE:n kuvaukseen on merkitty punaisella.

HiLoad 26/60 Superdex pg -geelisuodatuskromatografiakolonnin suorituskyky

Mon, 11 Apr 2016 00:00:00 +0000

Yleisin käyttämämme proteiinien puhdistustekniikka on geelisuodatus (jota kutsutaan myös kokosuodatuskromatografiaksi). Geelisuodatuksessa proteiinit erotellaan niiden koon perusteella (tai tarkemmin sanottuna niiden ”Stokesin säteen” perusteella, joka määräytyy suurelta osin niiden koon ja muodon mukaan). Suurten proteiinimäärien geelisuodatusta varten hankimme GE Healthcaren HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade noin 9 vuotta sitten (malli 26/60 on korvattu mallilla HiLoad 26/600, mutta molemmat ovat lähes identtisiä). Tällä kolonnilla voidaan erottaa erittäin puhtaasti kaksi proteiinia, joiden kokero ero on 100 %. Siksi se sopii saman proteiinin monomeeristen ja dimeeristen versioiden erottamiseen. Kolonnin ”viimeinen käyttöpäivä” oli maaliskuu 2012. Kokemuksemme mukaan tällainen kolonnin käyttöikä voi asianmukaisessa käsittelyssä helposti olla 10–15 vuotta (emme käytä sitä kovin usein, säilytämme sitä 20-prosenttisessa etanolissa, ja jos emme tarvitse sitä pidempään aikaan, säilytämme sitä +4 °C:ssa).

Arvostelu GE Healthcaren Äkta Avant 25 -laitteesta

Wed, 02 Mar 2016 00:00:00 +0000

Noin vuosi sitten saimme rahoitusta tiedekunnan sisäisessä hakukierroksessa vanhan Pharmacia Äkta Explorer 100 FPLC -laitteen Proteiinituotannon ja -puhdistuksen yhteislaitoksessa . Äkta Explorer oli hankittu vuonna 1996(?), kun ruotsalainen tuotemerkki Pharmacia oli vielä olemassa. Vuonna 2014 pahin mahdollinen skenaario toteutui, ja sekä monokromaattori että ksenon-salamalamput rikkoutuivat lähes samanaikaisesti, mikä aiheutti meille lähes 10 000 euron laskun. Siksi halusimme korvata laitteen nykyaikaisemmalla mallilla. Tällä alalla on vain kaksi yritystä, jotka tarjoavat luotettavia laitteita: GE Healthcare ( Äkta-tuotelinja ) ja BioRad ( NGC-tuotelinja ). GE Healthcare peri Äkta-tuotemerkin Pharmacialta useiden fuusioiden kautta, kun taas BioRad on suhteellisen uusi kilpailija NGC-malleillaan, jotka se toi markkinoille vasta muutama vuosi sitten.Päätimme valita Äkta Avant 25 . Halusimme ehdottomasti koteloidun, jäähdytetyn fraktiokerääjän. Halusimme myös tutun käyttökokemuksen. Suoritamme usein automatisoituja puhdistuksia, emmekä halua proteiinejamme olevan pitkiä aikoja huoneenlämmössä avoimissa putkissa, joihin bakteerit ja ilmasta tuleva pöly voivat päästä. Tähän mennessä olemme käyttäneet Äkta Avantia noin puoli vuotta, ja meillä on jo hyvä käsitys siitä, miten se vertautuu Äkta Exploreriin. Vaikka Avant on modernimpi kuin Explorer, kaikki ydinlaitoksemme käyttäjät käyttävät edelleen Exploreria. He ovat tottuneet Unicorn 5.11:n käyttöliittymään eivätkä näytä olevan kiinnostuneita oppimaan Avantin – myönnettäköön – monimutkaisempaa käyttöliittymää. Toinen syy siihen, että laitetta on toistaiseksi käytetty vain sisäisesti, oli kuitenkin se, että olemme kohdanneet melkoisen määrän ongelmia. Vanhan Äkta Explorer -laitteemme kanssa emme ole koskaan kohdanneet niin monia ongelmia niin lyhyessä ajassa peräkkäin. En tiedä, onko tilanteemme tyypillinen (GE Healthcaren edustajien mukaan se ei ole). Siitä huolimatta tässä ovat ongelmat, joita olemme kohdanneet:

FPLC-proteiinien puhdistuskurssi

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Kahdeksan jatko-opiskelijaa ilmoittautui joulukuussa järjestettyyn FPLC-proteiinipuhdistuskurssille . Jos jotain opin, niin sen, että kurssin aikana tehtävä proteiinien puhdistus tulisi AINA suorittaa käyttämällä proteiinia ja menetelmää, joita on aiemmin käytetty menestyksekkäästi LUKUISIA kertoja. Opiskelijoiden tuomat proteiinit ovat erinomainen oppimisen lähde, mutta kurssimuodon aikarajoitukset eivät antaneet meille mahdollisuutta saada näiden proteiinien puhdistusta valmiiksi kurssin aikana.Uuden Äkta Avant 25:n tekniset ongelmatLisäksi Äkta Avant 25 , jonka ostimme GE Healthcarelta tänä kesänä, rikkoutui KAKSI KERTAA kurssin aikana. Ensin ohjaus tietokone rikkoutui (RAID-vika). HP toimitti korvaavan kiintolevyn 24 tunnin kuluessa, ja kun RAID oli palautunut, pystyimme jatkamaan kurssia. Kuitenkin ensimmäisen tämän vian jälkeisen ajon aikana Äkta-laitteessa ilmeni ylipaineongelma. Tunnistimme syyksi viallisen virtauksenrajoittimen , mutta emme halunneet jatkaa, koska aiemmissa ajoissa oli ollut vakavia ongelmia ilmakuplien kanssa. Siksi suoritimme ajot vanhalla Äkta Explorer 100 -laitteella. GE Healthcare lähetti nopeasti huoltoteknikon tarkastamaan järjestelmän, mutta koska hänellä ei ollut varaosaa mukanaan, jouduimme odottamaan maanantaihin 14.12. asti, kunnes Äkta Avant oli jälleen täysin toimintakunnossa.Mitä puhdistimme: liukoinen VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) ja HepsinPuhdistimme liukoista ihmisen VEGF-reseptoria 3 (sen solunulkoisen domeenin kolme ensimmäistä domeenia, jotka on liitetty ihmisen IgG:n vakio-Fc-osaan). Tämä on puhdistus, jonka olemme tehneet monta kertaa. Se vastaa vasta-aineiden puhdistusta proteiini A-sefarosella.Olimme valmistaneet etukäteen konditionoidun soluviljelyväliaineen. Tuotamme suurimman osan proteiineistamme hyönteissoluissa (pääasiassa Drosophila S2), ja S2-solut olivat erittäneet VEGFR-3/Fc:n väliaineeseen sen jälkeen, kun metallotioneiinin promoottoria oli indusoitu 1 mM:n Cu2+-pitoisuudella noin 4,5 päivän ajan. Puhdistukseen tarkoitetun väliaineen valmistelu koostuu ainoastaan 1) solujen poistamisesta sentrifugoimalla ja 2) suodattamisesta saostumien ja muiden pienten hiukkasten poistamiseksi, jotka saattaisivat tukkia kolonnin. pH:ta ei tarvitse säätää.Nopea neutralointi matalan pH:n eluution jälkeen ON TÄRKEÄÄJuoksutimme väliaineen kertakäyttöisen 5 ml:n HiTrap-rekombinanttiproteiini A -kolonnin läpi yön noin 1 ml/min nopeudella ja eluoimme matalan pH:n puskurilla. Eluoidut 2 ml:n fraktiot neutraloitiin välittömästi 400 µl:lla 1 M Tris-liuosta (pH 8,5). Tässä vaiheessa teimme pienen virheen toisen puhdistuksen aikana. GE Healthcare ei ollut vielä tuonut markkinoille kasetteja 5 ml:n keräysputkille (eivätkä ole vieläkään tehneet niin, vaikka lupasivat ne jo syyskuuksi 2015), joten käytimme 15 ml:n Falcon-putkia 2 ml:n fraktioiden keräämiseen; niihin olimme etukäteen annostelleet 400 µl neutralointiliuosta. Sekoittuminen näissä putkissa ei kuitenkaan ollut tehokasta, ja pitkäaikainen altistuminen matalalle pH-arvolle johti proteiinimme osittaiseen vaurioitumiseen. Tämä näkyy, kun verrataan ryhmän 2 ja ryhmän 4 kokojakokromatogrammeja: Ryhmässä 4 ensimmäinen piikki (aggregaatti) on paljon suurempi ja heterogeenisempi verrattuna ryhmän 2 vastaavaan piikkiin. Itse asiassa, kun VEGFR-3/Fc eluoidaan matalalla pH:lla proteiini A -kolonneista, se saostuu aina suuremmilla pitoisuuksilla pian eluution jälkeen, mutta liukenee jälleen neutraloinnin yhteydessä. Tätä ei tapahtunut fraktioissa 5.A.3 ja 5.A.4 (ryhmä 4), koska eluaatin ja neutralointipuskurin sekoittuminen 15 ml:n Falcon-putkessa oli tehotonta (myös 2 ml:n fraktiokoko oli todennäköisesti syynä; 1 ml olisi ollut parempi). Ryhmän 2 ajon aikana poistimme putket heti ajon päätyttyä ja sekoitimme siten puskurit, kun taas ryhmän 4 osalta ajo päättyi yöllä ja eluaatti pysyi suurelta osin sekoittumattomana aamuun asti.Vaihtoehtoisesti olisimme voineet eluoida erittäin väkevällä kaootrooppisella suolalla lähes neutraalissa pH:ssa (mitä teemme seuraavalla kerralla, jos meillä on automatisoitu ajo, jossa eluointi tapahtuu keskellä yötä). Pierce tarjoaa (patentoidun) ”hellävaraisen” eluointipuskurin , jonka pH on 6,6. En tiedä Piercen puskurin koostumusta, mutta se on erittäin tiheä liuos jostakin kaootrooppisesta suolasta. 3 M kalium-/natriumtiosyanaattia tai 4 M magnesiumkloridia puskuroiduissa liuoksissa, joiden pH on noin 7, käytetään usein kaootrooppisina suoloina tähän tarkoitukseen. Hepsin Opiskelijoiden toimittamat proteiinit olivat haastavia. Ensinnäkin niiden pitoisuudet lähtöaineessa olivat hyvin alhaiset. Vaikka proteiini näkyy selvästi, kun VEGFR-3/Fc-konditionoitu elatusaine ajetaan PAGE-geelillä ja värjätään Coomassie-värillä, Hepsinille ei näy tällaista kaistaa. Lisäksi näytti siltä, että merkittävä osa proteiinista ei (enää) sisällä histagiinia, minkä vuoksi sitä ei saata talteen ensimmäisessä puhdistusvaiheessa. Se osa Hepsin-H6:sta, joka sitoutuu Ni2+-sefarosiin, eluoituu jo 20 mM:n imidatsolipitoisuudella, mikä vaikeuttaa kolonnin pesua. Hepsin, jossa on pidempi histagiini (H10), selviää 20 mM:n imidatsolipesusta, mutta sen ilmentymistasot ovat myös alhaiset. Alla on yksittäisten ajojen kromatogrammit ja merkityt kuvat Coomassie-värjätyistä PAGE-geeleistä. Äkta Avant 25:n käytön yksityiskohtainen ohje on vielä valmistumassa…

Neon-elektroporaatiolaite pettää

Tue, 04 Aug 2015 00:00:00 +0000

PÄIVITYS: Emme ole ainoita, jotka pyrkivät säästämään toimintakustannuksissaan. Tämä laboratorio julkaisi Neon-järjestelmällä tekemänsä kokeet lehdessä Analytic Biochemistry . Kiitos Joachim Goedhartille ( @joachimgoedhart ), joka toi tämän tietoon! Neon-transfektiolaite valmistajalta Life Technologies (oho, nykyään Thermo Fischer ja aiemmin Invitrogen ) tuotiin markkinoille noin viisi vuotta sitten. Se on suunniteltu nisäkässolujen helppoon elektroporointiin. Laite on ollut käytössämme vuodesta 2011 lähtien, mutta sitä ei ole juurikaan käytetty. En tiedä, johtuuko laitteen vähäinen käyttö sen käyttäjäepäystävällisyydestä (en vieläkään osaa kiinnittää elektrodin kärkeä pipettiin, vaikka olen tehnyt tämän satoja kertoja, mekaniikka on vain todella hankalaa), kalliista käyttökustannuksista (kertakäyttöisistä kullatuista elektrodeista ja valmistajan omasta transfektiopuskurista) vai jostakin muusta, jota en osaa selvittää. Haluaisin kuitenkin jakaa muutaman asian, sillä verkosta löytyy vain vähän todella hyödyllistä tietoa Neon-laitteesta.Ensimmäinen asia, josta meillä oli jatkuvasti ongelmia, olivat elektrodikärjessä olevat ilmakuplat, jotka johtavat katastrofaalisesti alhaiseen elektroporointitehokkuuteen. Ainoa tapa todella estää tämä on valmistaa vähintään 25 % enemmän solususpensiota kuin mitä tosiasiassa tarvitaan. Jos valmistat vain 10 % enemmän, viimeisessä elektroporoinnissa syntyy varmasti kipinöintiä väistämättömien ilmakuplien vuoksi (solususpensio tarttuu lisäksi helposti pipetin kärjen ulkopintaan, mikä lisää tarvetta valmistaa enemmän kuin todellisuudessa tarvitaan). Tämän seurauksena elektroporointipuskuri R loppui meiltä kauan ennen kuin pipetin kärjet loppuivat. Lisäksi puskuria R ei voi ostaa erikseen. Life Technologiesin edustaja, jonka kanssa olin yhteydessä, lupasi lähettää meille pienen erän pipetin kärkiä ja puskuria hyvän tahdon eleenä (se oli tammikuussa), mutta odotamme yhä niiden saapumista…Valitettavasti vanha Gene Pulser II -elektroporaatiolaite rikkoutui äskettäin. Bio-Rad ei enää korjaa sitä eikä myöskään toimita varaosia. Sitä käytettiin pääasiassa E. coli:n elektroporointiin. Tiesin, että Neon-laitetta ei ole suunniteltu E. coli:n elektroporointiin. Miksi ei, ja miksi sitä ei voi käyttää tähän tarkoitukseen? Kävi ilmi, että sähkökentän voimakkuus ei riitä läheskään E. coli:lle (BioRad Gene Pulser II:ssa tyypillisessä bakteerien elektroporoinnissa saavutetaan 12,5 kV/cm:n sähkökenttä, kun taas Neon saavuttaa hädin tuskin noin 850 V/cm). Kuitenkin (ajattelin), Neon pystyy tuottamaan paljon pidempiä pulsseja kuin Gene Pulser II (Neonin mainostetaan pystyvän tuottamaan jopa 100 ms:n pulsseja, kun taas Gene Pulser II:n tyypillinen pulssin pituus on noin 5 ms). Tämän lisäksi Neon pystyy lähettämään automaattisesti useita pulsseja. Halusin siis testata, voiko pitkä ja/tai toistuva pulssi, jonka kenttävoimakkuus on pienempi, transfektoida E. coli -bakteeria. Kävi kuitenkin ilmi, että kun E. coli:n transfektiopuskurina käytetään vettä (tai 10-prosenttista glyserolia) – kuten yleensä tehdään – laite ilmoittaa, ettei kärkielektrodi ole kosketuksessa. Tämä johtuu siitä, että laite tarkistaa, onko kärki asetettu oikein, lähettämällä pienen virran järjestelmän läpi, eikä virta kulje, jos E. coli on suspendoitu veteen. Jotta laite ”hyväksyisi” asetetun pipetin kärkielektrodin, tarvitaan 10–20 mM NaCl:ää. Käytin siis 15 mM natriumkloridia E. coli:n elektroporointipuskurina ja asetin elektroporointiparametrit arvoihin 2500 V ja 100 ms. Yllätys: Laite kieltäytyy antamasta tällaista pulssia, koska se on ”tehorajan yläpuolella!”. Suurin pulssin kesto, jonka se voi tuottaa 2500 V:n jännitteellä, on 19 ms. Valitettavasti edes tätä pulssia ei voida antaa automaattisesti useita kertoja (jälleen: ”tehorajan yläpuolella!”). Siksi suoritin tämän pulssin manuaalisesti 1–20 kertaa, mutta yksikään bakteeri ei saanut DNA:ta ja kaikki bakteerilevyt jäivät tyhjiksi. Käyttöohjeessa todetaan: `”Neon TM -laite on suunniteltu hyväksymään vain tiettyjä arvoja, ja kunkin arvon raja-arvot on lueteltu alla. Jos syöttämäsi arvo ylittää enimmäisarvon, näyttöön tulee virheilmoitus. Syöttöjännitealue: 500–2 500 V. Syöttöpulssin leveysalue: 1–100 ms. Syöttöpulssien lukumääräalue: 1–10.” Valitettavasti tämä voidaan ymmärtää hyvin helposti väärin. Minulle ei ollut selvää, ettei näiden alueiden sisällä olevia kolmea parametria voi yhdistellä vapaasti. Luulisi, että Life Technologylla olisi parempia teknisiä kirjoittajia (mutta ehkä he eivät käytä laitetta…). Johtopäätös: Laite on täysin käyttökelvoton mihinkään muuhun kuin nisäkässoluihin. Myös jotkut muut mielenkiintoiset sovellukset (kuten sukkulamatojen tai muiden pienten eliöiden elektroporaatio) ovat vaikeita tai mahdottomia. Vaikka laite saattaa olla hyvä valinta monille nisäkässoluille, se on paljon rajoitetumpi kuin vanhanaikainen BioRad Gene Pulser II. P.S.: Käytin puskuria E pipettiaseman täyttämiseen (käytettäväksi 10 µl:n kärkien kanssa). Testasin kuitenkin puskurin E sijaan myös seosta, jossa oli 90 % 150 mM natriumkloridia ja 10 % glyserolia (joka antaa saman johtavuuden kuin puskuri E). Haluaisin kuitenkin edelleen todella tietää puskurin R koostumuksen. Miksi? Koska uskon, että kärkielektrodeja voidaan kierrättää useammin kuin vain kaksi kertaa (muut pipettikärkielektrodien valmistajat mainostavat, että heidän elektrodejaan voidaan kierrättää paljon useammin (esim. BactoZapper , vaikka hekään eivät anna tarkkoja lukuja). Neonin käyttöohjeessa todetaan, että ”jos kärkiä käytetään useammin kuin kaksi kertaa, männän pinnalle voi muodostua oksidia, mikä heikentää männän elektrodin toimintaa”. Elektrodi on kullattu, ja kullan pitäisi kestää oksidien muodostumista paremmin kuin BactoZapperin ruostumattomasta teräksestä valmistetut elektrodit…

FastDigest®:tä vastaan esitetyt syytökset

Wed, 25 Jun 2014 00:00:00 +0000

Rajoitusentsyymit ovat edelleen tärkeitä

Vuonna 2006 innovatiivinen liettualainen bioteknologiayritys Fermentas toi markkinoille uuden tuotelinjan molekyylibiologian tutkijoille: FastDigest-rajoitusentsyymit. Yhdessä polymeraasiketjureaktion (PCR) kanssa restriktioentsyymit (RE) ovat kiistatta molekyylibiologian tärkeimpiä työkaluja. Ne mahdollistivat rekombinantti-DNA-tekniikan 1970-luvun alussa. Kunnes jokaisella laboratoriolla on varaa luotettavaan DNA-lasertulostimeen (mikä on todennäköisesti vielä vuosikymmenen päässä), restriktioentsyymit ovat alan vakiintuneita työkaluja. Uudet kloonaustekniikat (kuten In-Fusion , Gibson Assembly tai SLICE ) ovat löytäneet paikkansa, mutta niiltä puuttuu edelleen perinteisen restriktioentsyymikloonauksen luotettavuus.

Puhdistus

Fri, 01 Nov 2013 00:00:00 +0000

Kalvojen uudelleentutkiminen eri vasta-aineella on laboratoriossa hyvin yleinen tehtävä. Kalvojen puhdistamiseen on olemassa erilaisia menetelmiä, ja klassinen menetelmä on se, jossa käytetään SDS:ää, β-merkaptoetanolia ja kuumentamista. Tein sitä ennen itsekin tällä tavalla, mutta se on hajuhaitallista, koska β-merkaptoetanoli haisee mädiltä munilta. Sitten yhtäkkiä kaikki laboratoriossa alkoivat käyttää Milliporen Re-Blot Plus -liuosta, ja niin tein minäkin. Kunnes huomasin tarkistamalla turvallisuustiedotteen huomasin, että he myyvät halpoja kemikaaleja kalliilla hinnalla. Nyt valmistan puhdistuspuskurin itse. 10-kertaisen liuokseni koostumus on seuraava: