Proteiinit on Michael’s Domain

Proteiinipohjaisten lääkkeiden tutkimus ja kehitys

Wed, 09 Sep 2020 00:00:00 +0000

Eilen pidin ensimmäisen Zoom-luennon proteiinilääkkeiden tutkimuksesta ja kehittämisestä. Toivon, että opiskelijat saivat siitä ainakin jotain irti. Tavoitteenani on julkaista koko esitys CC-lisenssillä, mutta muutama kuva on vielä vaihdettava. Ensimmäinen yritys on harvoin täydellinen, ja meilläkin oli osansa teknisistä ongelmista. Kuulokkeeni pettivät ensimmäistä kertaa sen jälkeen, kun ostin ne Covid-19-pandemian alussa. Lisäksi Zoom-äänestystoiminto katosi ennen kuin opiskelijat ehtivät käyttää sitä, emmekä saaneet sitä enää toimimaan. Tässä on linkki reaaliaikaiseen Google Slides -esitykseen: https://mjlab.fi/pddd . Nämä muuttuvat jatkuvasti (= parantuvat). Alla on PDF-kuvakaappaus esityksestä varsinaiselta luentopäivältä. Koko esitys on CC-lisensoitu. Voit siis vapaasti käyttää sitä uudelleen. Kaikki lähdetiedostot (pääosin Inkscape SVG -muodossa) ovat saatavilla myös täältä: https://mjlab.fi/pddd-files . Olen tehnyt kaikki SVG-tiedostot Inkscapessa , mutta voit avata ne myös millä tahansa selaimella tai muokata niitä Adobe Illustratorissa. Jos haluat muokata tai poimia kuvia, helpoin tapa on ehkä ladata esitys Microsoft PowerPoint-, LibreOffice Impress- tai PDF-muodossa. En ole vielä keksinyt, miten voisin jakaa Google Slides -esityksen ilman, että alkuperäinen tiedosto muuttuu kaikkien muokattavaksi (haluanhan säilyttää jonkin verran hallintaa luentojeni sisällöstä).Huomaa, että tällä hetkellä esitys sisältää edelleen kahdeksan kuvaa, jotka perustuvat Fair Use -periaatteeseen tai joiden lisenssiehdot ovat tuntemattomat (vaikka oikeudellista fair use -käsitettä ei oikeastaan ole olemassa Yhdysvaltojen ulkopuolella). Kaikki kuvien lähteet (omia kuviani lukuun ottamatta) on lueteltu README.txt-tiedostossa niiden lisenssien ja lähde-URL-osoitteiden kera. Jotkut kuvat ovat niin vanhoja, etten enää löytänyt niiden alkuperäisiä URL-osoitteita. Siksi en ole varma niiden lisenssiehdoista. Aion korvata nämä kuvat seuraavien viikkojen aikana, kunhan onnistun hankkimaan CC-lisensoituja tai julkisen omaisuuden kuvia niiden tilalle.

Rekombinanttiproteiinien puhdistus ja karakterisointi

Mon, 20 Mar 2017 00:00:00 +0000

Järjestämme (jälleen) käytännönläheisen proteiinien puhdistuskurssin 4.–20. joulukuuta. Kurssille mahtuu enintään 16 osallistujaa, jotka jaetaan 2–4 hengen ryhmiin. Jokainen ryhmä tarvitsee kolme kokopäivää käytännön harjoitusten suorittamiseen, mutta kurssin kolmas päivä osuu päällekkäin seuraavan ryhmän ensimmäisen päivän kanssa. Kurssi pidetään Biomedicum Helsingissä, huoneissa A516a1 (jossa laitteet sijaitsevat) ja B318a/b (laboratoriossamme). Puhdistamme proteiinin (VEGF-reseptori 3) kaksivaiheisella menetelmällä (affiniteettikromatografia + geelisuodatus) Äkta Avant FPLC -laitteella. Kurssin kolmantena päivänä mittaamme proteiinin vuorovaikutusta sen ligandin (VEGF-C) kanssa ITC-laitteella (isoterminen kalorimetria). Olemme järjestäneet vastaavan kurssin vuonna 2015 ( http://www.helisci.fi/hbgs/FPLC2015/) . Tämä uusi kurssi ( https://courses.helsinki.fi/en/DPBM-135/120171139 ) on rakenteeltaan samanlainen, mutta olemme pidentäneet sitä yhdellä päivällä, jotta voimme analysoida proteiinien vuorovaikutuksia hyödyntämällä B3P-yksikkömme uutta isotermisen kalorimetrian laitetta. Kurssimateriaali ja tulokset ovat saatavilla myös täältä .Koska voimme käsitellä kerrallaan enintään kaksi näytettä (meillä on ”vain” kaksi FPLC-laitetta), joudumme jakamaan osallistujat ryhmiin (2–4 opiskelijaa ryhmässä) ja toistamaan kolmen päivän kurssin useita kertoja osallistujamäärän mukaan.

FPLC-proteiinien puhdistuskurssi

Mon, 04 Jan 2016 00:00:00 +0000

Kahdeksan jatko-opiskelijaa ilmoittautui joulukuussa järjestettyyn FPLC-proteiinipuhdistuskurssille . Jos jotain opin, niin sen, että kurssin aikana tehtävä proteiinien puhdistus tulisi AINA suorittaa käyttämällä proteiinia ja menetelmää, joita on aiemmin käytetty menestyksekkäästi LUKUISIA kertoja. Opiskelijoiden tuomat proteiinit ovat erinomainen oppimisen lähde, mutta kurssimuodon aikarajoitukset eivät antaneet meille mahdollisuutta saada näiden proteiinien puhdistusta valmiiksi kurssin aikana.Uuden Äkta Avant 25:n tekniset ongelmatLisäksi Äkta Avant 25 , jonka ostimme GE Healthcarelta tänä kesänä, rikkoutui KAKSI KERTAA kurssin aikana. Ensin ohjaus tietokone rikkoutui (RAID-vika). HP toimitti korvaavan kiintolevyn 24 tunnin kuluessa, ja kun RAID oli palautunut, pystyimme jatkamaan kurssia. Kuitenkin ensimmäisen tämän vian jälkeisen ajon aikana Äkta-laitteessa ilmeni ylipaineongelma. Tunnistimme syyksi viallisen virtauksenrajoittimen , mutta emme halunneet jatkaa, koska aiemmissa ajoissa oli ollut vakavia ongelmia ilmakuplien kanssa. Siksi suoritimme ajot vanhalla Äkta Explorer 100 -laitteella. GE Healthcare lähetti nopeasti huoltoteknikon tarkastamaan järjestelmän, mutta koska hänellä ei ollut varaosaa mukanaan, jouduimme odottamaan maanantaihin 14.12. asti, kunnes Äkta Avant oli jälleen täysin toimintakunnossa.Mitä puhdistimme: liukoinen VEGFR-3 (VEGFR-3/Fc) ja HepsinPuhdistimme liukoista ihmisen VEGF-reseptoria 3 (sen solunulkoisen domeenin kolme ensimmäistä domeenia, jotka on liitetty ihmisen IgG:n vakio-Fc-osaan). Tämä on puhdistus, jonka olemme tehneet monta kertaa. Se vastaa vasta-aineiden puhdistusta proteiini A-sefarosella.Olimme valmistaneet etukäteen konditionoidun soluviljelyväliaineen. Tuotamme suurimman osan proteiineistamme hyönteissoluissa (pääasiassa Drosophila S2), ja S2-solut olivat erittäneet VEGFR-3/Fc:n väliaineeseen sen jälkeen, kun metallotioneiinin promoottoria oli indusoitu 1 mM:n Cu2+-pitoisuudella noin 4,5 päivän ajan. Puhdistukseen tarkoitetun väliaineen valmistelu koostuu ainoastaan 1) solujen poistamisesta sentrifugoimalla ja 2) suodattamisesta saostumien ja muiden pienten hiukkasten poistamiseksi, jotka saattaisivat tukkia kolonnin. pH:ta ei tarvitse säätää.Nopea neutralointi matalan pH:n eluution jälkeen ON TÄRKEÄÄJuoksutimme väliaineen kertakäyttöisen 5 ml:n HiTrap-rekombinanttiproteiini A -kolonnin läpi yön noin 1 ml/min nopeudella ja eluoimme matalan pH:n puskurilla. Eluoidut 2 ml:n fraktiot neutraloitiin välittömästi 400 µl:lla 1 M Tris-liuosta (pH 8,5). Tässä vaiheessa teimme pienen virheen toisen puhdistuksen aikana. GE Healthcare ei ollut vielä tuonut markkinoille kasetteja 5 ml:n keräysputkille (eivätkä ole vieläkään tehneet niin, vaikka lupasivat ne jo syyskuuksi 2015), joten käytimme 15 ml:n Falcon-putkia 2 ml:n fraktioiden keräämiseen; niihin olimme etukäteen annostelleet 400 µl neutralointiliuosta. Sekoittuminen näissä putkissa ei kuitenkaan ollut tehokasta, ja pitkäaikainen altistuminen matalalle pH-arvolle johti proteiinimme osittaiseen vaurioitumiseen. Tämä näkyy, kun verrataan ryhmän 2 ja ryhmän 4 kokojakokromatogrammeja: Ryhmässä 4 ensimmäinen piikki (aggregaatti) on paljon suurempi ja heterogeenisempi verrattuna ryhmän 2 vastaavaan piikkiin. Itse asiassa, kun VEGFR-3/Fc eluoidaan matalalla pH:lla proteiini A -kolonneista, se saostuu aina suuremmilla pitoisuuksilla pian eluution jälkeen, mutta liukenee jälleen neutraloinnin yhteydessä. Tätä ei tapahtunut fraktioissa 5.A.3 ja 5.A.4 (ryhmä 4), koska eluaatin ja neutralointipuskurin sekoittuminen 15 ml:n Falcon-putkessa oli tehotonta (myös 2 ml:n fraktiokoko oli todennäköisesti syynä; 1 ml olisi ollut parempi). Ryhmän 2 ajon aikana poistimme putket heti ajon päätyttyä ja sekoitimme siten puskurit, kun taas ryhmän 4 osalta ajo päättyi yöllä ja eluaatti pysyi suurelta osin sekoittumattomana aamuun asti.Vaihtoehtoisesti olisimme voineet eluoida erittäin väkevällä kaootrooppisella suolalla lähes neutraalissa pH:ssa (mitä teemme seuraavalla kerralla, jos meillä on automatisoitu ajo, jossa eluointi tapahtuu keskellä yötä). Pierce tarjoaa (patentoidun) ”hellävaraisen” eluointipuskurin , jonka pH on 6,6. En tiedä Piercen puskurin koostumusta, mutta se on erittäin tiheä liuos jostakin kaootrooppisesta suolasta. 3 M kalium-/natriumtiosyanaattia tai 4 M magnesiumkloridia puskuroiduissa liuoksissa, joiden pH on noin 7, käytetään usein kaootrooppisina suoloina tähän tarkoitukseen. Hepsin Opiskelijoiden toimittamat proteiinit olivat haastavia. Ensinnäkin niiden pitoisuudet lähtöaineessa olivat hyvin alhaiset. Vaikka proteiini näkyy selvästi, kun VEGFR-3/Fc-konditionoitu elatusaine ajetaan PAGE-geelillä ja värjätään Coomassie-värillä, Hepsinille ei näy tällaista kaistaa. Lisäksi näytti siltä, että merkittävä osa proteiinista ei (enää) sisällä histagiinia, minkä vuoksi sitä ei saata talteen ensimmäisessä puhdistusvaiheessa. Se osa Hepsin-H6:sta, joka sitoutuu Ni2+-sefarosiin, eluoituu jo 20 mM:n imidatsolipitoisuudella, mikä vaikeuttaa kolonnin pesua. Hepsin, jossa on pidempi histagiini (H10), selviää 20 mM:n imidatsolipesusta, mutta sen ilmentymistasot ovat myös alhaiset. Alla on yksittäisten ajojen kromatogrammit ja merkityt kuvat Coomassie-värjätyistä PAGE-geeleistä. Äkta Avant 25:n käytön yksityiskohtainen ohje on vielä valmistumassa…

Puhdistus

Fri, 01 Nov 2013 00:00:00 +0000

Kalvojen uudelleentutkiminen eri vasta-aineella on laboratoriossa hyvin yleinen tehtävä. Kalvojen puhdistamiseen on olemassa erilaisia menetelmiä, ja klassinen menetelmä on se, jossa käytetään SDS:ää, β-merkaptoetanolia ja kuumentamista. Tein sitä ennen itsekin tällä tavalla, mutta se on hajuhaitallista, koska β-merkaptoetanoli haisee mädiltä munilta. Sitten yhtäkkiä kaikki laboratoriossa alkoivat käyttää Milliporen Re-Blot Plus -liuosta, ja niin tein minäkin. Kunnes huomasin tarkistamalla turvallisuustiedotteen huomasin, että he myyvät halpoja kemikaaleja kalliilla hinnalla. Nyt valmistan puhdistuspuskurin itse. 10-kertaisen liuokseni koostumus on seuraava:

Rekombinanttiproteiinit

Fri, 20 Jan 2012 00:00:00 +0000

Aiemmin täällä oli dynaamisesti linkitetty luettelo proteiineistani. Valitettavasti jouduin turvallisuussyistä luopumaan suorasta linkityksestä laboratoriomme tietokantapalvelimeen. Ehkä jonain päivänä löydän aikaa julkaista laboratoriomme pakastimien sisällön turvallisella tavalla täällä kotisivuillani. Siihen asti tässä on vain luettelo proteiineista, joita olen tuottanut. Jos sinulla on kysyttävää tai tarvitset proteiineja tutkimustarkoituksiin, ota rohkeasti yhteyttä minuun tai esimieheeni:

Äkta Explorer FPLC -keskuksen ydinlaitos

Wed, 26 Jan 2011 00:00:00 +0000

Nykyään käytän suuren osan työajastani angiogeneesiä ja lymfangiogeneesiä säätelevien proteiinien puhdistamiseen. Siksi huolehdin Molekyylisen syöpäbiologian tutkimusohjelman omistamasta välttämättömästä laitteistosta: nopeasta proteiinien nestekromatografialaitteesta (FPLC). Prof. Jorma Keski-Oja hankki noin 15 vuotta sitten yhden ensimmäisistä (ja vuonna 2010 tuotannosta poistettuja) Äkta Explorer -laitteita ruotsalaiselta valmistajalta Pharmacia (joka fuusioitui vuonna 1997 Amershamin kanssa muodostaen Amersham Pharmacia Biotech -yhtiön, jonka puolestaan GE Healthcare osti vuonna 2004). Vuonna 2000 laitteet siirrettiin Haartman-instituutista Biomedicum Helsinkiin . Vaikka olen ylläpitänyt tämän tutkimusinfrastruktuurin verkkosivuja viimeiset viisi vuotta (mukaan lukien online-varaukset ja tietojen varmuuskopiointi), ne olivat saatavilla vain Helsingin yliopiston verkon sisältä.Nyt olen onnistunut saamaan Äkta Explorer FPLC -keskuksen verkkosivut lisättyä Lääketieteellisen tiedekunnan . Tällä hetkellä olemme lisäämässä WAVE-soluviljelyjärjestelmää laitokseemme, jotta voimme tuottaa suuria määriä soluja ja soluviljelyn supernatanttia (jopa 25 litraa bakteeri-, hyönteis- tai nisäkässoluviljelyä) proteiinituotantoa varten.

HBGS-kurssi

Mon, 10 May 2010 00:00:00 +0000

Kaikki HBGS -kurssiin Proteiinien ilmentymisen, havaitsemisen ja puhdistamisen merkit liittyvät asiakirjat. Suurin osa asiakirjoista on saatavilla sekä PDF- että OpenOffice-muodossa. Voit vapaasti käyttää asiakirjoja muihin tarkoituksiin. Niiden lisenssi on Creative Commons Attribution-Noncommercial-Share Alike 1.0 -lisenssi .

Proteiinien varastointi ja käsittely

Wed, 22 Oct 2008 00:00:00 +0000