SnapGene on Michael’s Domain

Mahdoton overlap-extension-PCR

Sat, 21 Jun 2025 00:00:00 +0000

Väitöskirjatutkija kysyi minulta plasmidikarttoja useille DNA-konstrukteille, jotka olin kloonanut noin 20 vuotta sitten. Koska SnapGeneä ei ollut tuolloin olemassa, olin käyttänyt nykyään vanhentunutta GeneConstructionKit2-ohjelmaa. Tein tuohon aikaan paljon klonauksia, mutta en jaksanut karttojen luomista niistä kaikille. GCK2-muoto ei mahdollista helppoa annotointia. Plasmidien kattavaan annotointiin tarvittiin erillinen ohjelma, ja nämä tiedot tallennettiin erilliseen tiedostoon, niin sanottuun ”illstraatiotiedostoon” – mikä voisikaan mennä vikaan? Eilen päädyin kaivamaan esiin vanhat laboratoriomuistiinpanoni ja jäljittämään noin 10 vanhaa klonausta SnapGenessä. En kuitenkaan pystynyt simuloimaan yhtä kloonausta, koska SnapGene oli liian konservatiivinen ja ei sallinut ”huonojen” PCR-alukkeiden (primerien) toiminnan.

Vanhojen plasmidi-karttatiedostojen avaaminen

Sat, 01 Jan 2022 00:00:00 +0000

Uutta kloonausprojektia varten tarvitsimme pääsyn erään vanhan rakenteeni (pSecTagN2, joka oli [pMosaic]( https://doi.org/10.1074/jbc:n edeltäjä)M511593200), eli pSecTagI), jonka olin koonnut useista eri lähteistä vuonna 1999. Vuonna 1999 työskentelin Kari Alitalon laboratoriossa tohtoriopiskelijana. Olimme teknologian ”kärjessä”, sillä käytimme Gene Construction Kit (GCK) -nimistä ohjelmistoa kloonausprosessiemme seurantaan. Viime keskiviikkona käytin neljä tuntia työajastani yhden tiedoston avaamiseen, joka oli luotu GCK-versiolla 2.5 vuonna 1999.

OCAA-kirjaston Entry-vektorin (pENTR221) DNA-sekvenssin kokoaminen

Fri, 30 Oct 2020 00:00:00 +0000

Tämä artikkeli on tarkoitettu molekyylikloonausta harjoittaville. Tarkemmin sanottuna niille, joiden on käsiteltävä Gateway-vektoreita. Oletetaan, että olet saanut joltakulta Gateway-kloonin. Tiedät insertin sekvenssin ja tiedät vektorin runko-osat. Yksi yleisimmistä runko-osista on pENTR221. Otetaan esimerkkinä insertiksi ihmisen CTSL1-cDNA, tarkemmin sanottuna klooni-ID 100010639 OCAA-kloonikokoelmasta. Tiedät insertin sekvenssin sen rekisteröintinumerosta (BC012612).Haluat tämän vektorin täydellisen DNA-sekvenssin, jotta voit käyttää älykästä kloonausohjelmistoa, kuten SnapGene , apuna kloonaussuunnittelussasi. Tämä ohjelmisto edellyttää kuitenkin, että sinulla on konstruktin täydellinen sekvenssi (tai ainakin sen tärkeiden osien täydellinen sekvenssi). Miten siis selvität pENTR221-CTSL1-kloonin täydellisen sekvenssin? Insertisekvenssin saat NCBI:stä : Kirjoita vain kloonillesi saatu rekisteröintinumero. Lataa sekvenssi Fasta- tai Genbank-muodossa. Mielenkiintoista kyllä, muuten niin älykäs SnapGene-ohjelmisto ei tunne pENTR221-vektoria. Joten sinun täytyy googlettaa vektorin runko ”pENTR221 DNA sequence”. Tuloksia löytyy paljon, ja tässä on vain neljä niistä: 1. http://dnasu.org/DNASU/GetVectorDetail.do?vectorid=2792 . https://plasmid.med.harvard.edu/PLASMID/GetVectorDetail.do?vectorid=279 3. https://www.genomics-online.com/vector-backbone/48/pentr221/4 . http://yrgene.com/documents/vector/pentr221.pdfMatthias , neljännen lähteen kirjoittaja, esittää sekvenssin PDF-tiedostossa, mitä ei suositella. Jos kopioit DNA-sekvenssin tästä tiedostosta, se sekoittuu kokonaan, koska PDF-tiedosto ei lue 10 nukleotidin ryhmittelyjä rivi riviltä. Hyvä Matthias, älä käytä PDF-tiedostoa DNA-sekvenssien jakeluun tai dokumentointiin! Jos sinun on pakko tehdä niin, liitä PDF-tiedostoon tekstitiedosto, jossa on nukleotidisekvenssi! Tietenkin voit purkaa DNA-sekvenssin oikeassa järjestyksessä älykkäällä PDF-työkalulla, kuten PDF Studio Prolla. Jostain outosta syystä kolmannen URL-osoitteen sekvenssi poikkeaa muista neljästä, sillä se on ainoa, jossa on täydelliset kiinnityskohdat (attL1 ja attL2). Ei kuitenkaan ole väliä, mitä sekvenssiä käytät kokoonpanossa, koska erot ovat kaikki alueella, joka poistetaan kokoonpanoprosessin aikana (en tiedä, miten pENTR221-vektori valmisteltiin kirjaston kloonausta varten tässä nimenomaisessa esimerkissäni, mutta minusta näyttää siltä, että alkuperäinen vektori avattiin yhdellä DraI-pilkkomisella (joka luo tasaiset päät) ja sitten lisättiin ensin linkkeri ja sen jälkeen insertti. Ehdotan, että käytät kolmannesta URL-osoitteesta löytyvää sekvenssiä (koska se on Fasta-muodossa) ja tuot sen SnapGeneen, jolloin SnapGene tunnistaa yhteiset piirteet. Nyt tarvitset vielä linkkerin. Mistä tiedät, mitä linkkeriä on käytetty? Saamme suurimman osan Gateway-klooneistamme sisäisestä OCAA-kloonikokoelman kopiosta, ja voit ladata täydellisen klooniluettelon Excel-taulukkona täältä . Tiedot sisältävät jokaisesta kloonista käytetyn linkkerin (5’-linkkereitä on 8 erilaista ja 3’-linkkereitä 16 erilaista). Valitettavasti näyttää siltä, että tässä Excel-taulukossa on joitakin virheitä, sillä joissakin linkkereissä on stop-kodoni, mutta ne on silti merkitty ”ilman stop-kodonia” ja päinvastoin. Esimerkkikloonissamme on käytetty seuraavia linkkereitä: 5’-linkkeri: GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG 3’-linkkeri:TAGGACCCAGCTTTCTTGTACLähes kaikki 5’-linkkerit sisältävät Kozak-sekvenssin (CACC) viimeisinä nukleotideina ennen insertin alkua, ja muutamat sisältävät Kozakin lisäksi itse ATG:n (kuten yllä oleva). Linkkerin toisessa päässä homologisen sekvenssin tunnistaa helposti pENTR221-runko-osien attL1:n päästä (GTACAAAAAAG). 3’-linkkerit ovat heterogeenisempia, mutta ne kaikki sisältävät attL2:n CTTTCTTG-sekvenssin. Kun niitä käytetään stop-kodonin sisältävien kloonien tekemiseen, ne kaikki alkavat juuri kyseisellä stop-kodonilla (TAG, TGA tai TAA).Nyt sinun tarvitsee vain kopioida inserttijakson avoin lukukehys linkkerisekvenssien väliin. Jos 3’-linkkerissäsi on aloituskoodoni ATG, sinun on ohitettava se. Älä myöskään kopioi stop-koodonia, koska ”stop-koodonilla varustetuissa klooneissa” se sisältyy aina linkkeriin ja ”stop-koodonittomissa klooneissa” et halua sitä mukaan. Tässä esimerkissä tämä sekvenssi käsittää nukleotidit 202–1197 rekisteröintinumerosta BC012612 . Se olisi:AATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGNyt lisätään linkkeri (ensimmäinen ja viimeinen rivi):GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTAGGACCCAGCTTTCTTGTACNyt meillä on ensimmäinen ongelma: 3’-linkkerissä on pysäytyskodoni (heti viimeisen rivin alussa), vaikka klooni on saamamme tiedon mukaan ”ilman stop-kodonia”.Olemme sekvensoineet kloonin ja todenneet, että ainoa ero stopkodonilla varustetun ja ilman stopkodonia olevan kloonin välillä on mutaatio, joka muuttaa TAG-stopkodonin TTG-kodoniksi (leusiini). Joten vaihdamme yhden A-nukleotidin yllä olevassa sekvenssissä T-nukleotidiksi:GTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGAATCCTACACTCATCCTTGCTGCCTTTTGCCTGGGAATTGCCTCAGCTACTCTAACATTTGATCACAGTTTAGAGGCACAGTGGACCAAGTGGAAGGCGATGCACAACAGATTATACGGCATGAATGAAGAAGGATGGAGGAGAGCAGTGTGGGAGAAGAACGTGAAGATGATTGAACTGCACAATCAGGAATACAGGGAAGGGAAACACAGCTTCACAATGGCCATGAACGCCTTTGGAGACATGACCAGTGAAGAATTCAGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAAAACCGTAAGCCCAGGAAGGGGAAAGTGTTCCAGGAACCTCTGTTTTATGAGGCCCCCAGATCTGTGGATTGGAGAGAGAAAGGCTACGTGACTCCTGTGAAGAATCAGGGTCAGTGTGGTTCTTGTTGGGCTTTTAGTGCTACTGGTGCTCTTGAAGGACAGATGTTCCGGAAAACTGGGAGGCTTATCTCACTGAGTGAGCAGAATCTGGTAGACTGCTCTGGGCCTCAAGGCAATGAAGGCTGCAATGGTGGCCTAATGGATTATGCTTTCCAGTATGTTCAGGATAATGGAGGCCTGGACTCTGAGGAATCCTATCCATATGAGGCAACAGAAGAATCCTGTAAGTACAATCCCAAGTATTCTGTTGCTAATGACACCGGCTTTGTGGACATCCCTAAGCAGGAGAAGGCCCTGATGAAGGCAGTTGCAACTGTGGGGCCCATTTCTGTTGCTATTGATGCAGGTCATGAGTCCTTCCTGTTCTATAAAGAAGGCATTTATTTTGAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGACATGGATCATGGTGTGCTGGTGGTTGGCTACGGATTTGAAAGCACAGAATCAGATAACAATAAATATTGGCTGGTGAAGAACAGCTGGGGTGAAGAATGGGGCATGGGTGGCTACGTAAAGATGGCCAAAGACCGGAGAAACCATTGTGGAATTGCCTCAGCAGCCAGCTACCCCACTGTGTTGGACCCAGCTTTCTTGTACViimeinen vaihe on lisätä tämä sekvenssi tyhjään pENTR221-sekvenssiin, jonka olemme avanneet SnapGene-ohjelmassa. Käytännössä valitset 32 nukleotidia kohdista 652–687 ja korvaat ne yllä olevalla sekvenssillä. Voilà! Valitettavasti se, että linkkereitä ei aina ole merkitty oikein, herättää minussa huonoa aavistusta. Oman kokemuksemme mukaan Orfeomen kirjastokopiot sisältävät kuitenkin niin paljon virheitä, että on joka tapauksessa suositeltavaa sekvensoida koko insertti käyttämällä T7- tai M13 rev -alukkeita 3’-päästä ja M13 fwd -aluketta 5’-päästä. Tällä tavoin saat selville mahdolliset linkkerivirheet, joita on tehty kloonien annotoinnissa.

SnapGene ja osittaiset restriktioentsyymihajotukset uudelleen tarkasteltuna

Thu, 23 Aug 2018 00:00:00 +0000

SnapGene on ohjelmisto laboratoriossa työskenteleville molekyylibiologeille, jotka tekevät paljon kloonaustyötä (konstruktien suunnittelu ja annotointi). Siitä lähtien, kun viimeksi kirjoitin SnapGene-ohjelmistosta ( https://www.snapgene.com/ ), on tapahtunut monia hyviä asioita:

Etätyöpöytäyhteydet Helsingin yliopiston työtietokoneeseen

Mon, 15 Jan 2018 00:00:00 +0000

Jos sinulla on työkanula, voit viedä sen kotiin töiden tekemistä varten. Mutta entä jos sinulla on pöytätietokone ja haluat käyttää sitä kotoa käsin? Teknologia, joka mahdollistaa tämän, on ollut olemassa jo yli 20 vuotta, mutta jos luulet, että yliopiston IT-osasto olisi tehnyt tästä sinulle helppoa, olet väärässä. Itse asiassa en tunne ketään, joka osaisi tehdä tämän (puhumattakaan siitä, miten prosessi saataisiin sujumaan helposti). Jopa alla selitetyn asetuksen avulla jotkin asiat eivät toimi kunnolla (esim. en ole koskaan keksinyt, miten tiedostojen jakaminen saadaan toimimaan Mac-Mac-yhteydellä, joten käytän edelleen Fugua erillisen tunneloidun sftp-yhteyden kautta tiedostojen siirtämiseen). Sinulla on useita vaihtoehtoja:

SnapGene – Yksinkertaisesti paras DNA:n käsittelyohjelmisto

Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 +0000

Laboratoriossamme on käytetty erilaisia ohjelmistopaketteja DNA-rakenteiden suunnitteluun, dokumentointiin ja visualisointiin. Niistä, joista olemme jo pitkään pitäneet erityisen paljon, ovat Textcon GeneConstructionKit (GCK) ja Clone Manager (Professional) . Jälkimmäinen toimii valitettavasti vain Windowsissa. Koska useat tietokoneistamme käyttävät kuitenkin Ubuntu Linuxia , käytimme GCK:n versioita 2.5 ja 3 WINE:n -ohjelmalla (yhteensopivuuskerros, jonka avulla voimme käyttää alkuperäisiä Windows-ohjelmia Linuxissa). Päivityksen myötä versioon 4 GCK muuttui kuitenkin WINE:n alla käyttökelvottomaksi hitaudeksi, joten aloimme etsiä sille korvaajaa. Otimme yhteyttä GCK:n kehittäjiin, mutta he eivät ilmeisesti olleet halukkaita tai kykeneviä auttamaan meitä. Oletan, että GCK:n koodipohja on luultavasti yli 20 vuotta vanha, ja siksi kukaan ei uskalla koskea siihen. Juuri tuolloin SnapGene julkaistiin, ja se täytti lähes kaikki vaatimuksemme:

Hiljaisen mutageneesin työkalujen (EMBOSS, GCK) puutteet: WatCut ratkaisuna

Sun, 22 Feb 2004 00:00:00 +0000

Päivitys: Toukokuussa 2026 (Pittsburghin yliopiston ylläpitämän) WatCut-verkkopalvelun viimeinen toimiva instanssi lopetettiin. Snapgene ( https://snapgene.com ) ja muut vastaavat työkalut tarjoavat kuitenkin saman toiminnallisuuden (eli ne pystyvät tunnistamaan paikat mihin voi rakentaa uuden restriktiokohdan kahden nukleotidin hiljaisen mutageneesin avulla).