Kuka vielä tekee restriktioentsyymikloonausta?

Thu, 27 Jun 2024 00:00:00 +0000

Rajoitusentsyymit katkaisevat DNA:n tietyistä kohdista ja mahdollistavat siten – yhdessä DNA:ta sitovien entsyymien kanssa – molekyylitason leikkaa-ja-liimaa-toimenpiteet, jotka ovat edelleen nykypäivän rekombinantti-DNA-rakenteiden perustana. Vaihtoehtoisia kokoonpanomenetelmiä on aina ollut, mutta noin 10 vuotta sitten restriktiokohtien kloonaus sai vakavan kilpailijan yksiputkisista, homologiaan perustuvista kokoonpanostrategioista (etenkin ”Gibson-kokoonpanosta” ja sen johdannaisista). Tästä huolimatta restriktiokohtien asema on edelleen tärkeä kaikissa rekombinantti-DNA-laboratorioissa.Restriktioentsyymien laajaa valikoimaa tarjoavia kaupallisia toimittajia ei ole paljon. New England Biolabs ja ThermoFisher ovat kaksi suurta toimijaa ja ainoat toimittajat, joilla on tarjolla yli 200 erilaista entsyymiä. Kaikilla muilla toimijoilla (Roche, TaKaRa, Promega) on huomattavasti suppeampi valikoima. Noin 10 vuotta sitten väitin, ettei kenenkään pitäisi käyttää ThermoFisherin FastDigest-entsyymejä. Voit lukea kyseisen blogikirjoituksen , mutta sen ydinviesti on seuraava: ThermoFisher ei tarjoa entsyymeistään riittävästi tietoa, jotta niitä voitaisiin käyttää tasavertaisesti sekaympäristössä, jossa on mukana täysin avoimesti toimivien toimittajien, kuten New England Biolabsin (NEB), entsyymejä.Tämä sulkeutuneisuus on saanut ThermoFisherin keksimään oman määritelmänsä restriktioentsyymien aktiivisuudelle 5 minuutin ikkunan perusteella, mikä tekee suorista vertailuista kilpailijoiden entsyymien kanssa mahdottomia, koska nämä käyttävät standardina 1 tunnin ikkunaa. Koska entsyymit säilyvät reaktiossa vaihtelevan ajan ja koska ThermoFisher – toisin kuin NEB – ei tarjoa lainkaan tietoja entsyymiensä säilyvyysajoista, merkityksellistä vertailua ei ole mahdollista tehdä. Voidaan kysyä, oliko uuden yksikön määritelmän ainoana tarkoituksena estää vertailut. Pelkästään tämä olisi jo riittävä syy välttää ThermoFisheriä kuin ruttoa, mutta siihen ei jää. Vuonna 2014 huomautin, että ThermoFisherin ostettua Fermentasin, yhtään uutta FastDigest-entsyymiä ei ollut lisätty heidän tuotevalikoimaansa. Tämä väite pätee edelleen vuosikymmen myöhemmin (ja se pätee yhtä lailla perinteisiin restriktioentsyymeihin). Myös NEB:llä restriktioentsyymien kehitys on hidastunut, mutta vuodesta 2015 lähtien NEB on lisännyt valikoimaansa noin viisi HighFidelity-entsyymiä (ApoI, BbsI, BclI, BsiWI, BstZ17I) sekä muutamia perinteisiä restriktioentsyymejä.Suurin ongelma, jonka näen ThermoFisherin salailupolitiikassa, on se, että tuskin kukaan tietää, että he myyvät isoskizomeereja prototyyppientsyymin nimellä. Vaikka he kertovat avoimesti isoskizomeerien käytöstä muissa kuin FastDigest-tuotteissaan, he eivät paljasta FastDigest-entsyymiensä identiteettiä. Monet FastDigest-entsyymeistä ovat isoskizomeereja Arvydas Janulaitisin mukaan monet FastDigest-entsyymeistä ovat isoschizomeja. Janulaitis on Fermentasin entinen tieteellinen johtaja; kyseinen yritys kehitti FastDigest-järjestelmän ennen kuin ThermoFisher osti sen vuonna 2010. Äskettäin päivitetyssä esitteessä Thermo Scientific yrittää luoda kuvan ylivoimaisuudestaan NEB:hen nähden, mutta onnistuu huijaamaan vain kloonauksen aloittelijoita. Infografiikassaan he yrittävät korostaa puskurin valinnan yksinkertaisuutta ThermoFisherin restriktioentsyymivalikoimassa ja vertaavat sitä NEB:n valikoimaan.Se jättää kuitenkin huomiotta 190 perinteistä entsyymiään, jotka eivät ole yhteensopivia FastDigest-puskurin kanssa (ja tähän ryhmään kuuluu tärkeitä entsyymejä, kuten ”GoldenGate”-tyypin IIS-entsyymi BsmBI). Tietojen oikaisemiseksi olen laatinut paremman graafisen vertailun ThermoFisherin ja NEB:n välillä, joka on tämän blogikirjoituksen pääkuva. Jopa oma vertailuni on visuaalisesti harhaanjohtava, koska siinä ei oteta huomioon päällekkäisiä entsyymejä, joita ThermoFisherilla on paljon sen aggressiivisen yritysostostrategian vuoksi. Tässä vertailussa näyttää siltä, että ThermoFisher tarjoaisi enemmän erilaisia entsyymejä, mutta näin ei ole lainkaan. Redundanssit huomioon ottaen NEB:llä on 257 erilaista kaupallisesti saatavilla olevaa restriktioentsyymiä, kun taas ThermoFisherillä on vain 209. En laskenut niitä itse, vaan luotin parhaan kloonaussuunnittelu- ja dokumentointiohjelmiston SnapGene uusimpaan entsyymikuvaus-tiedostoon. Vuonna 2014 valitin, että heidän Fast Digest -puskurinsa koostumus on salainen, ja kun tarkistin asian tänään, tilanne oli edelleen sama. Thermo Fisherin restriktioentsyymien saralla ei ole tapahtunut lainkaan edistystä: ei innovaatioita, ei lisääntynyttä läpinäkyvyyttä.

Verta Ei Ole Tarpeeksi on Michael’s Domain

Kuka vielä tekee restriktioentsyymikloonausta?