FastDigest®:tä vastaan esitetyt syytökset

Rajoitusentsyymit ovat edelleen tärkeitä

Vuonna 2006 innovatiivinen liettualainen bioteknologiayritys Fermentas  toi markkinoille uuden tuotelinjan molekyylibiologian tutkijoille: FastDigest-rajoitusentsyymit. Yhdessä polymeraasiketjureaktion (PCR) kanssa restriktioentsyymit (RE) ovat kiistatta molekyylibiologian tärkeimpiä työkaluja. Ne mahdollistivat rekombinantti-DNA-tekniikan 1970-luvun alussa. Kunnes jokaisella laboratoriolla on varaa luotettavaan DNA-lasertulostimeen  (mikä on todennäköisesti vielä vuosikymmenen päässä), restriktioentsyymit ovat alan vakiintuneita työkaluja. Uudet kloonaustekniikat (kuten In-Fusion  , Gibson Assembly  tai SLICE  ) ovat löytäneet paikkansa, mutta niiltä puuttuu edelleen perinteisen restriktioentsyymikloonauksen luotettavuus.

Nopeus ja yksinkertaisuus

FastDigest-entsyymit tarjoavat kaksi uutta houkuttelevaa ominaisuutta: suuremman nopeuden ja yhden yleispuskurin. Näitä ominaisuuksia ei voi pitää itsestäänselvyytenä: yleensä useimmat laboratoriot varastoivat useita erilaisia puskureita restriktioentsyymeilleen. Ja useimmiten tutkija haluaa käyttää samanaikaisesti kahta eri restriktioentsyymiä, joiden puskurivaatimukset eivät ole yhteensopivia. Restriktiohajoitukset kestävät usein useita tunteja tai yön yli, joten tämän ajan lyhentäminen viiteen minuuttiin on ehdottomasti suuri etu.

FastDigest-entsyymien ja perinteisten restriktioentsyymien sekoittaminen kaksoishajoituksissa

Miksi en halua käyttää niitä? Koska niiden yhteensopivuudesta perinteisten restriktioentsyymien kanssa ei ole tietoa. Alun perin Fermentas ilmoitti verkkosivuillaan, että ”FastDigest™-puskuri sopii kaksoishajotuksiin sekä FastDigest™-entsyymien että tavallisten restriktioentsyymien kanssa” ( http://www.fermentas.com/techinfo/re/fastdigest.htm  , 15. maaliskuuta 2006; Internet Archiven mukaan). Tämä väite on kuitenkin sittemmin kadonnut, ja on vaikea kuvitella, että kaikki perinteiset entsyymit toimisivat yhdessä yleispuskurissa, kun otetaan huomioon, että joillakin on hyvin spesifiset reaktio-olosuhteet.

Innovaation loppu: puuttuvia restriktioentsyymejä ei ehkä koskaan muuteta FastDigest-versioiksi

Mutta miksi puskurien yhteensopimattomuus olisi ongelma? Jos käyttäisit yksinomaan FastDigest-entsyymejä, sinulla ei olisi koskaan yhteensopivuusongelmia! Valitettavasti tämä ei toimi, koska monia entsyymejä ei ole saatavilla FastDigest-muodossa. Eikä niitä todennäköisesti tule koskaan saataville kyseisessä muodossa, sillä Fermentas on ilmeisesti lopettanut FastDigest-tuotevalikoiman kehittämisen vuonna 2010, kun Thermo Fisher Scientific  osti yrityksen (katso yllä oleva kaavio). Thermo Fisher Scientific myy edelleen 191 perinteistä restriktioentsyymiä  , joten tämä kahtiajako on tullut jäädäkseen.

FastDigest-entsyymeille ei ole yhteensopivuustaulukoita

Meillä on pakastimessamme yli 100 perinteistä restriktioentsyymiä ja ehkä 20 FastDigest-entsyymiä. Eikä Thermo Fisher Scientific auta meitä yhdistelemään niitä: heidän verkossa oleva kaksoishajotustyökalunsa  sulkee pois FastDigest-entsyymit, ja he pitävät FastDigest-puskurin koostumuksen liikesalaisuutena. He ovat jopa keksineet näille entsyymeille uuden aktiivisuusyksikön (Fast Digest Unit: 1 FDU pilkkoo 1 µg kontrolli-DNA:ta 5 minuutissa FastDigest-puskurissa).

Thermon FastDigest-puskuri on todennäköisesti hyvin samanlainen kuin NEB:n CutSmart-puskuri

Toistaiseksi päätin vain lopettaa FastDigest-entsyymien ostamisen. Onneksi Thermo Fisher Scientificilla on kilpailija New England Biolabin High Fidelity -restriktioentsyymien  . Niidenkin etuna ovat lyhentyneet pilkkomisajat, universaali puskuri (”CutSmart”-puskuri) ja vähäisempi star-aktiivisuus. Toisin kuin Thermo Fisher Scientific, NEB ei jätä asiakkaitaan pimentoon CutSmart-puskurin koostumuksen suhteen: sen koostumus on sama kuin vanhalla NEBuffer 4:llä, paitsi että DTT puuttuu ja BSA on jo mukana. Koska NEBuffer 4 oli oletuspuskurina noin kahdessa kolmasosassa kaikista perinteisistä NEB-restriktioentsyymeistä, oli järkevää valita NEBuffer 4:ää vastaava yleispuskuri ja räätälöidä HF-entsyymit tätä puskuria varten. Oletan, että Fermentas teki samoin noin 10 vuotta sitten ja että FastDigest-puskurin koostumus on todennäköisesti hyvin samankaltainen kuin NEB:n CutSmart-puskurin…

PÄIVITYS (1. heinäkuuta 2014)

Olen ottanut yhteyttä Thermo Scientificiin ja pyytänyt lisätietoja. Itse asiassa heillä on sisäisesti enemmän yhteensopivuustietoja kuin mitä he tarjoavat verkkosivuillaan. He toimittivat minulle tiedot niistä FastDigest-entsyymeistä, joita käytämme (katso liitteenä oleva PDF-tiedosto). On outoa, että he eivät julkaise näitä tietoja verkkosivuillaan. Luulisin, että he vain hyötyisivät tietojen julkistamisesta. Se poistaisi kynnyksen FastDigest-entsyymien käytön aloittamiselle niissä laboratorioissa, jotka käyttävät perinteisiä entsyymejä…