Mahdoton overlap-extension-PCR

Väitöskirjatutkija kysyi minulta plasmidikarttoja useille DNA-konstrukteille, jotka olin kloonanut noin 20 vuotta sitten. Koska SnapGeneä  ei ollut tuolloin olemassa, olin käyttänyt nykyään vanhentunutta GeneConstructionKit2-ohjelmaa. Tein tuohon aikaan paljon klonauksia, mutta en jaksanut karttojen luomista niistä kaikille. GCK2-muoto ei mahdollista helppoa annotointia. Plasmidien kattavaan annotointiin tarvittiin erillinen ohjelma, ja nämä tiedot tallennettiin erilliseen tiedostoon, niin sanottuun ”illstraatiotiedostoon” – mikä voisikaan mennä vikaan? Eilen päädyin kaivamaan esiin vanhat laboratoriomuistiinpanoni ja jäljittämään noin 10 vanhaa klonausta SnapGenessä. En kuitenkaan pystynyt simuloimaan yhtä kloonausta, koska SnapGene oli liian konservatiivinen ja ei sallinut ”huonojen” PCR-alukkeiden (primerien) toiminnan.

Olin tehnyt overlap-extension-PCR:n luomaan mutaation hiiren VEGF-D-cDNA:han. Homologinen mutaatio oli aiemmin tehty ihmisen VEGF-D:hen, joten minulla oli alukkeet ihmisen sekvensseille. Hiiren ja ihmisen VEGF-D ovat hyvin samankaltaisia. Ihmisen PCR-monistusta varten suunnitellut alukkeet eivät olleet täydellisiä käytettäessä hiiren cDNA:ta mallina (template), mutta mikään eroista ei aiheuttanut muutoksia aminosarjahapossa. Joten yritin PCR:ää alukkeella, jossa oli emäsparivirhe (mismatch) kolmannessa nukleotidissa 3’-päästä katsottuna. PCR onnistui, mutta vaikka laskin hybridisaatioparametrit vähiten tiukoille asetuksille, SnapGene ei suostunut pariuttamaan (anneal) tätä aluketta malliini.

Simuloidakseni klonausta SnapGenessä ja luodakseni kartan, minun piti tehdä mutaatio alukkeeseeni ja kumota mutaatio overlap-extension-PCR:n jälkeen. Luulenpa, että minun täytyy tehdä vikailmoitus (vai olisiko tämä ominaisuuspyyntö?). Tuntuu kohtuulliselta, että ohjelman pitäisi pystyä sallimaan sellaisten alukkeiden pariutuminen, jotka pariutuvat todellisuudessakin…