Formel zur Berechnung der Annealing-Temperatur von Oligonukleotiden für die PCR

Die Faustregel zur Berechnung der Annealing-Temperatur für einen PCR-Primer lautet: Tm (°C) = 81,5 + 0,41(%GC) – (675/N), wobei %GC der prozentuale Anteil an G- und C-Nukleotiden im Oligo ist und N die Länge des Oligos in Nukleotiden angibt.

Rechenbeispiel

5’-TTAAAATGATAACCATCTCGC-3' Tm = 81,5 + 0,41(33,3) – (675/21) Tm = 81,5 + 13,7 – 32,1 (auf eine Dezimalstelle gerundet) Tm = 63,1°C

Bei der Wahl der Temperatur für den PCR-Annealing-Schritt ist Tm -5°C ein guter Ausgangspunkt; für das obige Beispiel wären das 58°C.